脂多糖誘導Kupffer細胞激活、焦亡及耐受機制研究進展*

譚定勇，秦凡博 綜述，程 瑤，龔建平△ 審校

(1.重慶市萬州區人民醫院普外科 404000；2.重慶醫科大學附屬第二醫院肝膽外科 400010)

Kupffer細胞是一類定植于肝臟中的巨噬細胞，是人體巨噬細胞中最大的一個群體，它的主要功能為吞噬病原菌、微生物、壞死細胞碎片及作為抗原呈遞細胞發揮作用。由于肝臟解剖位置的特殊性，使得其長期暴露于腸道來源的各種病原微生物環境中，因此，Kupffer細胞便組成了肝臟在面對各種病原微生物時的第一道屏障，因為其特殊的功能使得它在先天免疫系統及獲得性免疫系統中占據著重要的地位[1]。Kupffer細胞中可以表達多種模式識別受體(PRRs)，如表達在細胞膜上的Toll樣受體(TLRs)，細胞質中的Nod樣受體(NLRs)等，可以對細胞內或細胞外各種病原相關模式分子及危險相關模式分子進行識別，進而被激活。革蘭陰性菌的細胞壁脂多糖(LPS)為內毒素的主要構成，它是眾多可以激活Kupffer細胞使其發揮特定功能的物質中最經典的一類，LPS既往對于Kupffer細胞激活的研究多是聚焦于其依賴的TLRs途徑，近年來在關于巨噬細胞的研究上，發現了另外一種非TLRs依賴的信號通路，而這條信號通路的激活依賴于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶11(caspase-11)并會伴隨炎癥因子白細胞介素-1β(IL-1β)和IL-18的釋放，細胞本身經此途徑激活后則會發生一種炎癥形式的細胞死亡即細胞焦亡。Kupffer細胞的激活與內毒素耐受的現象有很大聯系，因為內毒素耐受依賴于各種調節因素對Kupffer細胞激活通路上各個環節的精密調控，這其中包括了許多負性調節蛋白的表達改變，以及近年來廣受關注的腫瘤壞死因子受體相關因子3(TRAF3)泛素化修飾和非編碼RNA在其中的作用。

1 LPS誘導Kupffer細胞激活的信號通路

1.1細胞外LPS激活Kupffer細胞的信號通路 Kupffer細胞可以被多種刺激物激活，如革蘭陰性菌的細胞壁LPS、細菌及真菌的β葡聚糖、補體因子C3a和C5a等,激活的Kupffer能夠上調多種炎癥介質如IL-6、IL-12、IL-18、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及干擾素-γ(INF-γ)等[2]。在這些眾多的激活Kupffer細胞的刺激物中，LPS是最為經典且研究得最深入的一種，LPS主要通過作用于TLRs家族中的TLR4起到激活細胞的作用。Toll蛋白最早是在20世紀90年代果蠅體內發現的一種參與天然免疫反應的蛋白，與果蠅類似，人類細胞中的TLRs是一種Ⅰ型跨膜蛋白，它可以廣泛識別各種病原體相關模式(PAMPs)，如細菌、病毒的DNA、RNA及真菌等，是機體天然免疫的重要組成成分。在人類細胞中，被證實的TLRs有10種，肝臟中Kupffer細胞、內皮細胞、肝星狀細胞及肝實質細胞等均大量表達TLRs。LPS引起的TLR4通路的激活方式目前大多認為是以下過程：血漿中的脂質結合蛋白(lipid-binding protein,LBP)與LPS相結合，將LPS運輸到與錨定在脂質膜上脂筏區域中的CD14相結合，CD14將LPS轉運并與髓樣分化因子2(myeloid differentiation factor 2,MD2)相結合，最終形成TLR4/MD2復合物的二聚體，二聚體的形成是炎癥開始的第一步[3]。最近，LI等[4]揭示了一種影響TLR4活性的新機制，T3JAM(TRAF3-interacting JNK-activating modulator，T3JAM)可以作為一種分子鉗來“收緊”TLR4，促進其向脂筏區域易位，最終增強巨噬細胞介導的炎癥。LPS通過與TLR4和MD-2作用形成的復合體隨后會活化髓樣分化因子88(myeloid differentiation primary response gene 88，MyD88)依賴的下游通路或形成TLR4的內吞體。一方面，MyD88被募集后進一步招募白細胞介素受體相關激酶1(interleukin-1 receptor-associated kinase,IRAK1)、IRAK2、TNF受體相關因子(TNF receptor-associated factor 6,TRAF6)等蛋白形成蛋白復合物，最終這個蛋白復合物可以分別激活核因子-κB(NF-κB)及JNK/p38 MAPK信號通路；另一方面，除了依賴于MyD88激活NF-κB和JNK/p38 MAPK通路外，LPS被轉位進入TLR4的內吞體內，隨后招募TRIF、TRAF3及其他蛋白，使得INF調節因子IRF3發生磷酸化，最終上調(INF-Ⅰ)的表達[5]。

1.2細胞內LPS激活Kupffer細胞的信號通路 Kupffer細胞雖為人體主要的巨噬細胞群體，但專門針對細胞內LPS激活Kupffer細胞的信號通路相關研究仍較少，但一些對于LPS感染巨噬細胞的相關研究卻能提示Kupffer細胞中也可能存在類似激活途徑。既往很長一段時間研究者們認為LPS只能在細胞外作用于TLRs激活巨噬細胞，然而，KAYAGAKI等[6]最早發現當小鼠巨噬細胞感染某些革蘭陰性菌如大腸桿菌、鼠傷寒沙門菌、福氏志賀菌后，會出現一種依賴于caspase-11的炎癥因子釋放，而且caspase-11可以殺死巨噬細胞內從囊泡逃逸出的這些細菌。這些現象說明了這些革蘭陰性菌可能通過某個相同的病原體相關模式分子能夠激活caspase-11。caspase-11在正常狀態下的細胞中表達常較低，但可以使用不同的TLRs激動劑誘導caspase-11在細胞內表達升高，因此，HAGAR等[7]和KAYAGAKI等[8]用不同的TLRs激動劑預處理Kupffer細胞后，使用電穿孔的方法，將革蘭陰性菌共有的成分LPS轉染進細胞，發現caspase-11被激活，此外，KAYAGAKI等[8]還發現了是LPS的脂質A成分作用于caspase-11的CARD結構域才可以將其激活。因此，這兩個獨立的實驗均證明了細胞內的LPS依賴于caspase-11可以激活Kupffer細胞。另外，在LPS是如何進入Kupffer細胞這個問題上，又有許多學者展開了研究。有觀點認為，細胞內的鳥苷酸結合蛋白可以通過對包含革蘭陰性菌的囊泡及包含LPS的外膜囊泡(out-membrane vesicles,OMVs)進行裂解使LPS在細胞內定位[9]。最近，DENG等[10]發現在膿毒血癥中，高遷移率族蛋白1(HMGB1)可以結合LPS通過晚期糖基化終產物(RAGE)受體進入細胞質，隨后通過溶酶體的作用使LPS在細胞質中釋放出來[10]。除此之外，還有研究者認為LPS進入細胞可能還與LBP有關，因為他們發現當細胞外LPS濃度升高時，細胞質內的LPS-LBP復合物也會隨之升高，但LBP介導LPS進入細胞的具體機制仍有待探索[11]。當細胞內的LPS或革蘭陰性菌激活caspase-11后，會產生兩方面的效應：一方面，活化的caspase-11可以介導Kupffer細胞發生炎癥的程序性死亡，即細胞焦亡；另一方面，它可以通過激活核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白-凋亡相關顆粒樣蛋白(NLRP3-ASC)復合體激活caspase-1，從而使炎癥因子IL-1β、IL-18成熟釋放。由于既往的關于NLRP3經典炎癥小體的激活與此激活途徑有很大差別，故也將此條途徑稱之為非經典NLRP3炎癥小體激活通路。現普遍認為由caspase-11激活引起的鉀離子外流是最關鍵的因素[12]。YANG等[13]發現，活化的caspase-11可以通過切割細胞膜上的pannexin-1蛋白使鉀離子外流及ATP釋放，鉀離子外流使NLRP3/ASC/caspase-1通路激活，而ATP釋放則與焦亡相關。除鉀離子外，溶酶體中的組織蛋白酶B的釋放也與NLRP3非經典炎癥小體通路的激活相關， CHEN等[14]發現在Kupffer細胞中，LPS可能會使溶酶體膜結構的穩定性遭到破壞，使其中的組織蛋白酶B從中釋放，而組織蛋白酶B的釋放使caspase-11的激活增強，從而通過上述途徑激活非經典NLRP3炎癥小體，但LPS是如何影響溶酶體膜的結構還有待進一步探索。

2 細胞內LPS誘導的Kupffer細胞焦亡

細胞內LPS通過上述信號通路將巨噬細胞或Kupffer細胞激活之后，除了能夠分泌多種炎癥介質參與促炎或抗炎反應外，這些細胞內LPS還可以誘導巨噬細胞發生一種炎癥形式的程序性死亡，即細胞焦亡。焦亡分為2條途徑：經典焦亡途徑與非經典焦亡途徑，而細胞內的LPS或革蘭陰性菌誘導的Kupffer細胞焦亡屬于非經典焦亡途徑。以往的研究者不清楚caspase-11(在人類細胞中則為caspase-4/5)的下游關鍵分子機制，以至于無法很好解釋LPS介導的Kupffer細胞死亡。KAYAGAKI等[15]和SHI等[16]通過不同的方法找到了焦亡下游的關鍵分子Gasdermin D(GSDMD)。KAYAGAKI等[15]通過小鼠基因的大量變異去篩選與caspase-11介導的焦亡相關的基因；SHI等[16]通過基因編輯技術找到了caspase-1和caspase-11介導的焦亡下游的共同分子。他們發現，被激活的caspase-11會去切割這個分子，從而使該分子的N端從自我抑制的C端中釋放出來，釋放出的N端是細胞發生焦亡的關鍵。隨后，DING等[17]又說明了N端導致細胞死亡的原因[17]，他們發現被切割下來的N端可以結合脂質膜并能在細胞膜上形成由16個單元圍成的直徑約為10～14 nm的孔洞，因滲透壓的作用從而引起細胞腫脹死亡。除GSDMD介導的焦亡外，YANG等[13]發現，pannexin-1和P2X7對于Kupffer細胞的焦亡也至關重要，因為在缺乏這兩個蛋白時細胞內的LPS誘導的細胞焦亡程度會減弱，并且野生型小鼠相較于這兩個基因被敲除后的小鼠更容易在LPS的刺激下死亡，機制上解釋為，激活的caspase-11切割pannexin-1使ATP釋放，ATP的釋放作用于細胞膜上的P2X7，從而使非選擇性陽離子通道開放，誘發細胞焦亡。

細胞焦亡作為一種炎癥形式細胞死亡的方式，可以通過殺滅感染細胞及釋放炎癥因子兩個手段達到使感染局限以抵抗感染的作用，除此之外，通過細胞內LPS激活非經典NLRP3炎癥小體通路也能使炎癥因子的釋放增多。現在認為焦亡主要發生在一些具有吞噬功能的細胞中，比如Kupffer細胞、樹突狀細胞、內皮細胞等[18]，而Kupffer細胞作為人體巨噬細胞中最大的一個群體，專門針對Kupffer細胞的焦亡或是炎癥小體通路的研究卻相對較少。因此，若進一步理解焦亡和炎癥小體在Kupffer細胞中的作用，可能會為感染相關的疾病如膿毒血癥、內毒素休克等提供新的治療靶點。

3 Kupffer細胞內毒素耐受機制的研究進展

3.1內毒素耐受概念及TLRs通路上的負性調控因子 內毒素耐受指的是，當預先給予小劑量的LPS刺激之后，在隨后的大劑量LPS作用下，機體會表現出較低的炎性反應或是不表現出炎性反應的現象。這種現象與許多膿毒血癥患者感染的后期發生免疫麻痹在原理上有許多的相似之處。肝臟長期暴露在來源于腸道微生物刺激的環境下，卻不表現明顯炎癥，其中，Kupffer細胞的內毒素耐受發揮著至關重要的作用。內毒素耐受時可以發生TLRs受體的下調、信號分子的改變、轉錄因子的負性調控及染色質的組蛋白修飾[19]等。在TLR4信號通路的各個環節上，內毒素耐受會使TLR4表達下調、TLR4對MYD88及TRIF招募的降低、IRAK1/4的活性降低及通過形成無活性的p50二聚體影響NF-κB活性[20-21]。除此之外，還包括一些作用于此條通路中負性調節因子的上調，現已被證實的包括Pellinon3負性調控TLR4/TLR2信號通路、IRAK-M抑制IRAK1/IRAK4激酶、SHIP1抑制JNK和p38磷酸化從而抑制MAPK信號通路、SCOS1負調控TLR4/MYD88通路、Twist-2阻斷NF-κB促炎癥轉錄等[22-26]。

3.2TRAF3的泛素化修飾在Kupffer細胞內毒素耐受中的作用 TRAF3為腫瘤壞死因子受體家族成員之一，其生物學功能依賴于它的K48泛素化降解及K63自身泛素化激活，由于它在內毒素耐受中可以影響JNK/p38 MAPK通路及TRIF通路[27]，因此對于TRAF3泛素化修飾在內毒素耐受中相關的研究近年來有不少的報道。LI等[28]發現，內毒素耐受時MAPK通路發生了重編程，機制上是通過Pellinon1介導的cIAP2的K63泛素化抑制及TRAF3的K48泛素化降解的抑制來實現，并且還在膽管炎患者體內也驗證了Pellinon1的上調及TRAF3的下調的現象。同一個團隊中的WEN等[29]也發現了在Kupffer細胞內毒素耐受時USP25這種專門針對TRAF3的去泛素化酶表達會出現上調，然后通過抑制TRAF3的K48泛素化連接從而抑制其降解，最終抑制MAPK通路實現內毒素耐受。

3.3非編碼RNA對TLRs信號通路的調控在Kuffer細胞內毒素耐受中的作用

3.3.1微RNA(microRNA,miRNA)對Kuffer細胞內毒素耐受的調控 miRNA為一類長度約為22個核苷酸的非編碼小RNA，可以與mRNA非翻譯區的3′端的多個位點結合，起到對mRNA轉錄后的負性調控作用。近年來，研究者發現miRNA對于TLRs信號通路的調控在內毒素耐受中十分重要。如miRNA-98(miR-98)可以抑制IL-10的分泌，而在Kupffer細胞內毒素耐受時，miR-98下調，從而使對IL-10翻譯的抑制減弱[30]。miR-221、miR-579和miR-125b均可以對TNF-α進行抑制，其中miR-221促進TNF-α降解，miR-579和miR-125b抑制TNF-α轉錄[31]。另有研究表明miR-146α和miR-155可以同時通過染色質的三維空間對同一個基因共同定位，用相同的轉錄機制和相似的對Histone3甲基化譜的作用共同調節內毒素耐受的形成[32]。SEELEY等[33]通過對免疫耐受相關的miRNA的篩查發現，miR-221和miR-222可以通過依賴于SWI/SNF和STAT介導的染色質重塑，調節Brg1基因，使得一系列炎癥因子相關的基因轉錄沉默，從而達到免疫耐受的狀態，且膿毒癥患者免疫麻痹的發生也被證實伴隨著miR-221/222的表達升高。

3.3.2長鏈非編碼RNA(LncRNA)對內毒素耐受的調控 LncRNA是一類長度超過200個核苷酸不編碼蛋白的調節RNA，與miRNA多在轉錄后水平調控的專一機制有所區別，LncRNA可以在多個水平上用多種機制參與生理病理過程的調控。LncRNA的表達譜在LPS激活TLRs通路時發生了很大的變化。DU等[34]發現，LncRNA Mirt2可以在LPS刺激后的Kupffer細胞中起到負性調節TLR信號通路的作用，它是通過抑制TRAF6的K63泛素化從而影響NF-κB及JNK/p38 MAPK通路，抑制炎性反應。在LPS誘導的炎性反應中，LncRNA MALAT1可以與NF-κB在核內作用，抑制TNF-α、IL-6的表達水平[35]。除此之外，最近也有研究發現，TLR4信號通路的耐受可以逆轉LPS誘導的LncRNA PCGEM1、LncRNA HOTTIP的抑制及LncRNA snaR的上調，但這些LncRNA在免疫耐受狀態下的具體作用還有待探索[36]。總之，有許多LncRNA的變化都可以調節TLRs信號通路的重編程，但大多數LncRNA的表達及它們的功能在內毒素耐受中的作用尚未得到驗證，可以預見，這些LncRNA在Kupffer細胞內毒素耐受時的作用及機制也將成為以后的研究熱點。

4 總結與展望

Kupffer細胞其數量龐大且功能復雜，LPS刺激Kupffer細胞后可以通過多種信號通路將其激活，這些被激活的信號通路的改變對于Kupffer細胞的焦亡及Kupffer細胞介導的內毒素耐受有著十分重要的作用。細胞焦亡的相關研究雖然大多數并沒有專門集中在Kupffer細胞當中，但是也可以從其他類型的細胞如單核Kupffer細胞、樹突狀細胞、神經膠質細胞中尋找有關于Kupffer細胞焦亡的線索。Kupffer細胞內毒素耐受的研究在蛋白質翻譯后修飾及非編碼RNA等領域取得一些進展?？傊?，對于Kupffer細胞激活、焦亡及內毒素耐受機制的研究，將會為解決某些臨床問題如膿毒癥、肝臟移植免疫耐受及肝臟腫瘤等提供新的理論支持。