白色念珠菌與表皮葡萄球菌混合生物膜研究進展*

楊繼琛，黃云超 綜述，葉聯華 審校

(昆明醫科大學第三附屬醫院/云南省腫瘤醫院胸外科一病區，昆明 650118)

醫用生物材料已在臨床上廣泛應用，但生物材料植入引起的感染成了困擾臨床工作的難題。表皮葡萄球菌是院內感染常見的條件致病菌，其黏附在生物材料表面形成生物膜，引起植入物相關感染。細菌生物膜(bacterial biofilm，BF)是細菌附著于惰性或活性實體表面，并由自身分泌的細胞外基質包裹形成的結構性細菌群落[1]。生物膜內的細菌耐藥性極強，在感染部位難以徹底清除，臨床上約65%的感染與微生物在組織、器官或醫療設備表面形成生物膜有關[2]。患者在治療過程中及免疫力低下時常并發白色念珠菌混合感染，形成細菌-真菌混合生物膜，耐藥性更強，治療難度更大。其病死率為單一病原微生物感染的2倍，臨床治愈非常困難[3]，因此，對細菌-真菌混合生物膜感染的控制成為臨床亟待解決的問題。本文對白色念珠菌-表皮葡萄球菌細菌混合生物膜的形成相關因素、結構、特征、耐藥機制等進行綜述，總結其相關研究進展。

1 白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜的形成與結構

有關白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜的形成與結構的報道大多通過體外實驗獲得，陳穎等[4]通過在聚氯乙烯(PVC)材料表面建立白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜體外模型來觀察混合生物膜的形成與微觀結構。將表皮葡萄球菌與白色念珠菌混懸液在PVC材料表面進行共培養，在培養2、6、12、24、48、72 h時用激光共聚焦顯微鏡及掃描電鏡觀察各時間點混合生物膜結構。研究表明，混合生物膜的形成主要分為初始黏附和細菌分泌外黏質聚集兩個階段。在共培養早期(2～6 h)，表皮葡萄球菌黏附于真菌細胞上，二者通過菌體表面多糖黏附素、甘露糖蛋白、疏水性蛋白等與PVC材料表面發生界面效應并在表面黏附。之后病原菌相互聚集形成菌落，病原菌厚度增加并分泌大量黏液包裹菌體，48 h時厚度達峰值，形成成熟生物膜。

48～72 h時，由于生物膜內微生物代謝及營養物質逐漸消耗，生物膜主體收縮并趨于穩定。生物膜外層與主體連接不緊密并易脫落，脫落后可發生再次黏附，進入生物膜生長的下一周期循環。掃描電鏡觀察到生物膜主體中部分菌體固縮、崩解，呈現以單個或數個菌絲態酵母菌黏附多個表皮葡萄球菌的珠串形態；三維重建顯示混合生物膜表面有較多活菌構成的凸起，隨著培養時間延長，PVC膜表面孢子狀白色念珠菌逐漸伸長，變化為假絲狀及菌絲狀。成熟期白色念珠菌生物膜為具有有機三維結構的致密網狀系統，在細胞外基質包裹下由孢子、菌絲體和假菌絲組成。表皮葡萄球菌附著于白色念珠菌菌絲四周，構成復雜多層次網狀混合生物膜。

2 混合生物膜形成的影響因素

2.1菌體蛋白對生物膜的影響 白色念珠菌細胞壁特別是細胞壁蛋白對于真菌的生長、毒性、致病性，尤其是細胞壁在提供對宿主組織的黏附和抵抗宿主的防御功能上非常重要。白色念珠菌凝集素樣序列(agglutinin like sequence,ALS)基因家族成員中的ALS3是白色念珠菌菌絲特有基因，其編碼的細胞壁糖蛋白Als3P誘導酵母菌對宿主的黏附，而且Als3與菌絲細胞壁蛋白1(hyphal wall protein 1，Hwp1)、聚苯乙烯黏附增強蛋白1(Eap1)構建一個具有互補黏附功能的網絡，以便有效對宿主進行定植、黏附，在混合生物膜形成過程中，通過綁定葡萄球菌到ALS3P的N-末端片段區域和異體表達ALS3p的酵母菌重組體上而使葡萄球菌黏附到白色念珠菌的菌絲上，而且白色念珠菌具有高度保守的淀粉樣蛋白形成序列，能使白色念珠菌互相聚集。ALS3p在促進白色念珠菌菌絲的內吞作用方面起著重要作用,ALS3基因缺失的真菌株不能形成結構完整的生物膜[5-6]。

白色念珠菌的Hwp1由HWP1基因編碼，其促進細胞壁的形成、菌絲發育和對宿主細胞的黏附，對于細胞內信號傳導有重要作用。Hwp1能促進白色念珠菌與宿主上皮細胞在黏附早期的結合，HWP1基因缺失株在體內外均不能形成完整生物膜[7]。 在高等真核生物中，酪蛋白激酶1 (CK1)家族是Wnt信號通路的一部分，并調控細胞分化、跨膜運輸、DNA損傷反應等，近年來發現，酵母酪蛋白激酶2(CaYck2p)是CK1家族的主要真菌同源物，在大多數真核生物中存在高度保存的絲氨酸/蘇氨酸激酶家族成員。作為一種多功能激酶，它控制著酵母菌形態發生、生物膜形成、細胞壁的完整性和與宿主細胞的相互作用[8]，尤其是CaYck2p可能在調控菌絲特異性基因的遺傳抑制和調節細胞壁的代償性形成方面發揮重要作用。研究發現，當白色念珠菌在酵母誘導條件下生長尤其是在酵母到菌絲轉變期間，CaYck2p通過使轉錄因子uMe6 mRNA表達增加，其下游菌絲特異性基因ALS3、HWP1和SUN41表達下調來調節酵母菌形態發生、生物膜形成和對宿主細胞的損傷。增強菌絲生長基因(enhanced filamentous growth，efg)1通過調節 RME1、STE12 基因的表達調控菌絲的形成及酵母菌細胞的形態轉換，與生物膜形成密切相關[9]。

在表皮葡萄球菌生物膜的形成過程中，表皮葡萄球菌纖維蛋白原結合蛋白(fibrinogen binding protein，fbe)基因編碼的纖維蛋白原結合蛋白(Fbe)、細胞間黏附素A (intercellular adhesion gene，ica) 基因編碼的多糖胞間黏附素(polysaccharide intercelluar adhesion，PIA)、聚集相關蛋白(accumulation associated protein,aap)基因編碼的聚集相關蛋白(Aap)等多種因子均有參與。

在黏附階段，fbe基因編碼合成的Fbe與宿主纖維蛋白原相結合，使表皮葡萄球菌黏附于生物材料表面，從而介導生物膜形成[10-11]。在細菌增殖和聚集階段則通過PIA、Aap等蛋白起作用。Ica基因在表皮葡萄球菌生物膜感染中起重要作用，其編碼的蛋白PIA是表皮葡萄球菌生物膜形成聚集階段的必需物質[12]，可促進BF三維立體結構的形成并增強BF耐藥性，是目前發現的與表皮葡萄球菌致病性關系最為密切的因子[11]。表皮葡萄球菌生物膜的形成是個動態過程，首先由細菌表面疏水性蛋白或細胞外多糖對生物材料初始附著，隨后細菌通過PIA介導相互聚集，形成BF。掃描電鏡觀察發現，ica操縱子陽性表皮葡萄球菌在PVC材料表面可形成結構致密、高度組織化的BF結構；而ica操縱子陰性表皮葡萄球菌在PVC材料表面只有部分細菌附著，無成熟BF結構形成。這可能是因為后者含初始黏附相關基因(atl E、fbe)，表現為初步黏附，但缺乏ica操縱子介導BF聚集，因而未能形成成熟的BF。

Aap是一種以鋅依賴的方式自組裝的細胞壁錨定蛋白，介導生物膜內的細胞間黏附，促進生物膜增厚并成熟[13]。細胞壁錨定蛋白附著點附近存在低復雜性區域，Aap蛋白的C終端部分包含一個135 aa長的脯氨酸/甘氨酸富集區(PGR)，該區域包含一組18個幾乎相同的AEPGKP重復序列。利用生物物理技術對PGR分析表明，該區域是一種高度擴展、本質上無序的多肽，具有異常高的多聚脯氨酸Ⅱ型螺旋傾向。用超離心法分析和動態光散射法測定表明，PGR在溶液中的整體構象狀態與溫度有最小的依賴關系。PGR在加入滲透劑三甲胺N-氧化物或助溶劑2，2，2-三氟乙醇時，具有抗構象崩解或α-螺旋形成的能力。這些結果表明，PGR是一種有彈性的、延伸的長柄，可以從細菌細胞壁向外延伸，促進生物膜內細菌間的黏附，說明Aap作為聚集階段的一個重要因子，在生物膜形成中發揮一定作用。

PAHARIK等[14]研究表明，Aap的作用獨立于PIA，Aap在發揮細胞間黏附作用時需要蛋白水解及裂解，金屬蛋白酶SepA調控著與堆積相關的蛋白質處理和表皮葡萄球菌細胞間黏附的表面特性，應用重組蛋白研究表明，SepA能夠在335殘基處裂解Aap的A區域，在601殘基處裂解A、B之間的區域，進而使Aap發揮作用。在PIA陰性的表皮葡萄球菌1457Δica，金屬蛋白酶SepA對Aap依賴的表皮葡萄球菌是必需的。調節劑SarA抑制SepA的活性，sarA失活會增加SepA的產生，反過來增強生物膜的形成。因此，在aap基因介導的生物膜成熟過程中，分泌葡萄球菌蛋白酶是生物膜形成的一個重要因素。

研究者通過建立表皮葡萄球菌和白色念珠菌混合生長的體外生物膜模型研究表明，混合培養能形成比單一微生物結構更復雜的混合生物膜，在混合生物膜形成過程中，存在細菌與真菌不同水平的相互作用，使表皮葡萄球菌icaA、fbe、aap基因表達上調，PIA、Fbe、Aap蛋白生成增加;白色念珠菌als3、hwp1、efg1基因表達上調，相應蛋白表達增加。表皮葡萄球菌和白色念珠菌同時存在于生物材料表面后，表皮葡萄球菌黏附在白色念珠菌菌絲及孢子表面，混合生物膜較單一微生物生物膜更厚、生長動力學更高，結構更致密、更復雜。

2.2密度感應與生物膜 細菌和真菌可以通過合成和釋放細胞外信號分子即密度感應分子(quorum sensing molecule，QSM)以改變相鄰細胞間的信號傳遞來調節自身的活動[15]。白色念珠菌酵母態和絲狀體生長兩種形式相互轉化的能力對其致病性非常重要。QSM在生物膜的生長和調控中起著重要的作用，這些分子有一種獨特的作用機制，它們在細胞生長過程中不斷地產生與細胞質量成正比的物質，導致QSM靶基因的協同表達。用高濃度的法尼醇孵育白色念珠菌幾乎完全抑制生物膜的形成。法尼醇也能減少表皮葡萄球菌生物膜的生成[16]。法尼醇通過抑制Ras蛋白通路，誘導白色念珠菌凋亡；通過下調絲裂原活化蛋白(mitogen-activated protein，MAP)激酶和PKA(cAMP-protein kinase A)激酶通路來來抑制細菌胚管的形成，誘導菌絲向孢子轉變以抑制菌絲形成，影響真菌的形態[17]。近年來研究表明，法尼醇在白色念珠菌生成的起始階段，通過對翻譯和轉錄成分的調控，即針對真核起始因子2B (eIF2B)，影響其mRNA與小核糖體亞基的相互作用，降低啟動核糖體復合物的水平，通過在翻譯途徑上的不同步驟抑制菌絲的合成，抑制白色念珠菌的絲狀生長[18]。王小燕等[19]通過熒光定量PCR研究表明，用法尼醇處理過的混合生物膜中表皮葡萄球菌生物膜形成相關基因icaA、aap、fbe和白色念珠菌生物膜形成相關基因als3、hwp1、efg1的表達均下調，進而影響生物膜的形成。

3 耐藥機制

生物膜的形成與抗真菌藥物的耐藥性密切相關。研究表明，在生物膜形成的第48小時，生物膜內的白色念珠菌與浮游細胞相比，對抗真菌藥的耐藥性增加了5～8倍，這種耐藥性的增加是很多因素綜合作用的結果[20]。

3.1滲透屏障 生物膜由細胞外基質(extracellular matrix，ECM)及被其黏結的細菌組成。ECM主要由多糖、蛋白質和核酸組成，有助于生物膜的形成，保護生物膜的結構，維持細胞之間和細胞表面與環境之間穩定的相互作用。胞外多糖(extracellular poly saccharide，EPS)是組成生物被膜結構的基質物,其中β-葡聚糖能夠綁定氟康唑和兩性霉素B，阻止藥物滲透到生物膜；堿溶性多糖(alkali-soluble polysaccharides，ASPs)則對抗真菌藥物起螯合作用或阻隔作用。胞外DNA(eDNA)是真菌和BF的關鍵基質成分，能夠附著在不同的表面，與其他大分子物結合，使生物膜具有結構完整性和穩定性，DNA產物的增加促進了念珠菌生物膜的成熟及對抗真菌藥物的能力[21]。但混合生物膜內表皮葡萄球菌的EPS基質過量產生會干擾菌絲之間的黏附，增加生物膜的毒性和耐藥性[22]。

3.2耐藥基因表達 白色念珠菌ATP結合轉運蛋白超家族(ATP-binding cassette，ABC)構成一個多基因耐藥家族，其中白色念珠菌耐藥(Candida drug resistance，CDR)基因CDR1、CDR2 和多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)基因MDR1 的過度表達是白色念珠菌耐藥的重要機制之一，它們的過度表達可將進入白色念珠菌細胞內的藥物泵出細胞外，起抗生素外排泵的作用。在白色念珠菌生物膜形成的早期階段，CDR和MDR基因表達上調，這種上調對抗真菌耐藥性的形成是非常重要的，隨著生物膜的成熟，甾醇成分的變化似乎更相關，且耐藥性不僅僅依賴于一個單一的機制。近年來研究發現，在生物膜內部也發現一種持久細胞，該細胞是一種休眠的、對抗菌藥物具有高度耐受性的非分裂細胞。收集幸存的持留菌細胞再培養后，藥敏實驗顯示其最低抑菌濃度(MIC)并沒有增髙；并可以形成新的生物膜，再次接受高濃度抗真菌藥物沖擊后，絕大多數真菌細胞仍然被殺滅，僅有與原始菌株相似水平的極少數持留菌細胞幸存。白假絲酵母菌持留菌是具有多藥耐藥性，不具備遺傳特性的表型變異細胞，被認為是生物膜耐藥的主要原因[23]。培養這些生物膜中的持續細胞能檢測出CDR基因的表達[19]。ABC蛋白參與真菌交配因子和聚量感應分子的分泌,這些分子會影響生物膜的結構和行為，從而導致耐藥性的增加[24]。在混合生物膜中，細菌真菌之間不同水平互相作用，使表皮葡萄球菌生物膜形成相關基因icaA、fbe、aap表達上調，從而使生物膜在形成過程中的黏附聚集能力增強，ECM增厚，這是耐藥性增強的一個重要原因。生物膜形成時發生接觸誘導表達及轉錄活性的改變,使更多的基因表達，導致生物膜形成過程中白色念珠菌及表皮葡萄球菌代謝增強,耐藥性增加[10]。

4 小 結

白色念珠菌與表皮葡萄球菌混合生物膜是多種細胞共存的形式，其復雜的形成過程和形態決定了混合生物膜相關感染治療極為困難。目前對白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜的結構和特性有了初步的了解，但仍存在很多問題有待探究，隨著對混合生物膜研究的深入，可找到控制其感染的新方法。