高通量轉(zhuǎn)錄組測序在人類配子發(fā)生及植入前胚胎發(fā)育研究中的應(yīng)用進(jìn)展

羅斌，呂自力，單旭東，趙情梅，梁鑫

(成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬生殖婦幼醫(yī)院，成都 610041)

高通量測序(next generation sequencing，NGS)是現(xiàn)代分子生物手段運(yùn)用比較普遍的技術(shù)，其中高通量轉(zhuǎn)錄組技術(shù)(RNA sequencing，RNA-Seq)更是為臨床研究提供了便捷的手段。轉(zhuǎn)錄組(transcriptome)是組織或細(xì)胞在特定環(huán)境或生理狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄表達(dá)的所有RNA的轉(zhuǎn)錄本，即包括編碼/非編碼蛋白的mRNA，以此來判斷這段特殊基因組區(qū)域的轉(zhuǎn)錄水平，可以從整體上反映出細(xì)胞中基因的表達(dá)情況及其調(diào)控規(guī)律。因此，RNA-Seq技術(shù)為研究基因表達(dá)及調(diào)控提供了重要的手段和方法，得到廣泛使用。

配子細(xì)胞及早期胚胎的RNA含量低，難以達(dá)到轉(zhuǎn)錄組測序建庫所需要的RNA最小起始量要求。早期構(gòu)建的體外培養(yǎng)的人卵母細(xì)胞、4-細(xì)胞、8-細(xì)胞和32-細(xì)胞期的文庫[1]，為今后的研究奠定了基礎(chǔ)。隨著NGS、RNA-Seq及Smart-seq2等微量測序技術(shù)的建立與發(fā)展，以及單細(xì)胞基因組測序技術(shù)的運(yùn)用，使RNA-Seq技術(shù)的運(yùn)用變得更加成熟，擺脫了轉(zhuǎn)錄組建庫RNA含量低的束縛。許多研究小組已經(jīng)利用SAGE技術(shù)、生物芯片、原位雜交和基因敲除等方法對人類卵母細(xì)胞、植入前胚胎以及單個器官的發(fā)育進(jìn)行了基因表達(dá)及轉(zhuǎn)錄本的研究。有研究者利用基因敲除等方法經(jīng)過數(shù)年的研究，發(fā)現(xiàn)與男性不育癥密切相關(guān)的基因近200個[2]，這些基因的突變、缺失或表達(dá)異常，可能是男性不育癥發(fā)生的重要原因。目前已成功利用RNA-Seq技術(shù)在人植入前胚胎發(fā)育[3]及其他物種[4]的早期胚胎發(fā)育調(diào)控機(jī)制方面開展過一些初步研究，而人類配子發(fā)生方面的轉(zhuǎn)錄組研究較少。高通量RNA-Seq技術(shù)具有顯著的優(yōu)勢，可以在較短時間內(nèi)大規(guī)模研究組織或細(xì)胞里多個基因的差異表達(dá)，篩選相關(guān)基因，也可以研究細(xì)胞通路和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為解析不孕不育調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

一、RNA-Seq對配子發(fā)生的研究

1.卵母細(xì)胞研究：RNA-Seq技術(shù)已經(jīng)運(yùn)用在人類著床前胚胎發(fā)育過程中基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理等方面的研究，但對卵母細(xì)胞的測序研究較少[5]。有學(xué)者對人類卵母細(xì)胞極體和原核進(jìn)行單細(xì)胞全基因組測序分析，并確定了其卵母細(xì)胞的雜交圖譜，推斷出疾病相關(guān)等位基因中的非整倍體和單核苷酸多態(tài)性(SNP)，獲得了減數(shù)分裂重組信息[6]。對比基因組測序，RNA-Seq技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢，可以比較正常和異常發(fā)育卵母細(xì)胞之間的分子水平差異：定量揭示基因調(diào)控以及表觀遺傳變異引起的基因表達(dá)缺陷，也可以分析SNP及調(diào)節(jié)通路，而這些基因調(diào)控超出了DNA測序的檢測范圍。有學(xué)者利用單細(xì)胞RNA-Seq技術(shù)對體外和體內(nèi)成熟的人卵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測序分析，發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)人類卵母細(xì)胞成熟的關(guān)鍵基因與細(xì)胞通路，從RNA測序數(shù)據(jù)中篩選成熟相關(guān)的差異表達(dá)基因2 230個[7]，如ACAT1、HADHA和ALDH2等基因；并發(fā)現(xiàn)81條細(xì)胞通路，其中，27%與代謝有關(guān)，19%與信號通路有關(guān)。

2.精子發(fā)生過程研究：精子發(fā)生障礙主要是由基因突變和染色體異常的遺傳缺陷引起的。近年來，基因組范圍的微陣列和RNA測序研究豐富的生精細(xì)胞群體或模型動物的睪丸樣本，為人類精子發(fā)生的分子控制提供了基礎(chǔ)。Montjean等[8]用基因表達(dá)探針法對比不育男性和正常男性的精液差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)大約15%的調(diào)控基因在精子發(fā)生中起作用。RNA-Seq技術(shù)可以篩選異常基因，為男性不育提供了新的線索。Djureinovic等[9]利用RNA-Seq技術(shù)對人睪丸組織進(jìn)行了深入測序，并與其他器官組織進(jìn)行了比較，根據(jù)表達(dá)模式將人類基因進(jìn)行分類，結(jié)果表明睪丸是迄今為止組織特異性最強(qiáng)的基因。同樣，Zhu等[10]利用RNA-Seq技術(shù)對人類睪丸組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，也發(fā)現(xiàn)睪丸組織的特異表達(dá)基因最多。

通過運(yùn)用RNA-Seq技術(shù)與1 000多份高豐度精子轉(zhuǎn)錄本比對中，鑒定出900多份參與了精子發(fā)生、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、精子運(yùn)動和能力、受精和胚胎發(fā)生等生物學(xué)過程的基因，將這些基因用于比較受精卵和雄性精子的mRNA產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)特發(fā)性不孕癥患者生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜與生育個體之間的不同[11]。另外，有研究通過對卡爾曼綜合征(KS)患者單個精子細(xì)胞測序與正常精子基因組序列比較，發(fā)現(xiàn)有數(shù)百個差異表達(dá)基因[12]，這為KS患者臨床治療指明了方向。最近Chen等[13]應(yīng)用精度高的單細(xì)胞RNA-Seq方法，建立小鼠精子發(fā)生過程的轉(zhuǎn)錄組圖譜，揭示了精子發(fā)生過程中基因表達(dá)調(diào)控的動態(tài)變化，這為人類精子轉(zhuǎn)錄組研究奠定了基礎(chǔ)。

RNA-Seq在篩選精子發(fā)生相關(guān)基因應(yīng)用上有巨大潛能：通過一些生物技術(shù)手段鑒定了大量與精子發(fā)生相關(guān)的基因。與生精功能相關(guān)的基因有很多，如ODF1、ODF2和CLOCK等[14-16]。與生精相關(guān)的其他基因及與運(yùn)動相關(guān)的基因也需要進(jìn)一步的發(fā)掘研究。利用免疫組化等方法通過對PIWI蛋白相互作用RNA(PIWI/piRNA)通路的研究，發(fā)現(xiàn)該通路與人類無精子癥相關(guān)，即該通路可能在精子發(fā)育的過程中有著重要的保護(hù)作用[17]。另外，有研究人員利用單細(xì)胞高通量全基因組測序技術(shù)對單個精子細(xì)胞進(jìn)行研究，鑒定出20多個在二倍體細(xì)胞基因組中并不存在的單核苷酸突變[18]

因此，RNA-Seq技術(shù)為我們提供了很好的篩選基因的工具，對篩選精子發(fā)生和卵母細(xì)胞成熟相關(guān)基因有巨大的潛能。采用高通量RNA-Seq技術(shù)能為我們發(fā)掘病理相關(guān)基因，更高效的研究細(xì)胞信號通路及表觀遺傳，為進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。

二、RNA-Seq對植入前胚胎發(fā)育的研究

1.早期胚胎的轉(zhuǎn)錄組研究：RNA-Seq技術(shù)已經(jīng)運(yùn)用于人類著床前胚胎發(fā)育過程中基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理等方面的研究。Dobson等[19]通過分析人類著床前胚胎的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)近2 000種mRNA在Day3的表達(dá)有明顯變化，而只有小部分基因在Day1～2上調(diào)或下調(diào)。Vassena等[20]通過RNA-seq分析人類單個胚胎，成功建立人類胚胎資源數(shù)據(jù)庫，為綜合分析胚胎發(fā)育過程調(diào)控提供了參考。Yan等[3]利用單細(xì)胞RNA-seq技術(shù)測定人類著床前胚胎和胚胎干細(xì)胞的基因表達(dá)，檢測到20 000多個表達(dá)的基因，包括8 000多個長非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)，并成功繪制出完整的人類著床前單胚胎轉(zhuǎn)錄組精細(xì)圖譜，為今后胚胎發(fā)育的研究奠定了基礎(chǔ)。單細(xì)胞RNA-Seq技術(shù)將逐漸應(yīng)用到臨床實(shí)踐中，方便對人類早期胚胎細(xì)胞基因程序化解析。

2.胚胎表觀遺傳研究：高通量RNA-Seq改進(jìn)方法也得到了廣泛運(yùn)用。Guo等[21]利用微量細(xì)胞DNA甲基化高通量測序技術(shù)，對人類早期胚胎發(fā)育過程中DNA甲基化重編程的系統(tǒng)深入解讀。另外，利用高精度的單細(xì)胞多組學(xué)測序技術(shù)，成功解析了人類著床前胚胎發(fā)育過程中DNA甲基化組和染色質(zhì)狀態(tài)組的重編程過程，以及染色質(zhì)狀態(tài)與DNA甲基化之間的相互關(guān)系等關(guān)鍵生物學(xué)特征[22]。隨后該研究團(tuán)隊(duì)采用單細(xì)胞DNA甲基化高通量測序技術(shù)，繪制出人類著床前胚胎發(fā)育的DNA甲基化圖譜，進(jìn)一步揭示了胚胎的去甲基化重編程以及父源/母源基因組差異甲基化等特征[23]。

Wu等[24]采用RNA-Seq技術(shù)，發(fā)現(xiàn)人類早期胚胎發(fā)育過程中基因組轉(zhuǎn)錄激活對于開放染色質(zhì)區(qū)域重編程的關(guān)聯(lián)性，為深入理解人類胚胎早期發(fā)育表觀遺傳調(diào)控提供了理論基礎(chǔ)。同年，Li等[25]研究證明了人類和小鼠胚胎中父源/母源基因組的染色質(zhì)開放程度差異：人類胚胎不同于小鼠胚胎的物種特異性的關(guān)鍵表觀遺傳學(xué)特征。這為研究非整倍體等發(fā)育異常的胚胎，以及反復(fù)流產(chǎn)等臨床醫(yī)學(xué)問題提供了新思路和新研究手段。

3.植入前胚胎檢測：自然流產(chǎn)和不孕不育比例逐年增加，利用NGS技術(shù)可精確排查染色體變異的原因，提高治療效率。體外受精患者的妊娠失敗絕大部分都是由于胚胎的非整倍性造成的，導(dǎo)致胚胎停止發(fā)育而發(fā)生流產(chǎn)的重要原因之一是胚胎的染色體異常，因染色體數(shù)目異常引發(fā)的自然流產(chǎn)率高達(dá)23%以上。Carvalho等[26]比對了全基因組拷貝數(shù)變異(copy number variants，CNVs)數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)其中與胚胎停育及早期流產(chǎn)相關(guān)的致病性CNVs約29個。另外，RNA-Seq可用于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)絨毛組織的染色體拷貝數(shù)變異分析，檢測出亞顯微結(jié)構(gòu)的染色體異常[27]。RNA-Seq方法檢測率高、分辨率高，對自然流產(chǎn)患者的遺傳咨詢及生育指導(dǎo)具有重要意義。

NGS技術(shù)在輔助生殖治療中最經(jīng)典的應(yīng)用是胚胎植入前遺傳學(xué)診斷(PGD)和植入前遺傳學(xué)篩查(PGS)。基于NGS技術(shù)的PGS/PGD將大大提高移植率、妊娠率，降低流產(chǎn)率。PGS/PGD結(jié)合RNA-Seq技術(shù)可在較短的時間內(nèi)給予病因?qū)W診斷，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)熒光原位雜交(FISH)技術(shù)、染色體核型分析和微陣列比較基因組雜交(CGH)等技術(shù)的不足。因此，RNA-Seq技術(shù)在胚胎植入前遺傳學(xué)診斷中有極大的優(yōu)勢，其應(yīng)用效果和價(jià)值較高，可以解決因囊胚形成率低而無可活檢的胚胎用于PGD的難題。

4.早期胚胎發(fā)育相關(guān)基因研究：早期胚胎發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)了大量相互調(diào)控的相關(guān)基因，RNA-Seq技術(shù)可以大規(guī)模篩選這些基因。早期胚胎發(fā)育是遺傳信息依據(jù)一定的時間、空間和次序表達(dá)的結(jié)果，伴有大量基因的激活，如胚胎細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子NANOG、OCT4和CLDN4等基因。NANOG能調(diào)控合子基因組的激活，缺乏NANOG的胚胎合子基因組激活率低、發(fā)育受阻，而CLDN4抑制因子也會導(dǎo)致胚胎不能形成正常的囊胚腔[28-29]。早期胚胎的發(fā)育屬母型調(diào)控，母源mRNA在胚胎發(fā)育早期起著重要生理作用[30]。隨著發(fā)育的進(jìn)行，發(fā)育從母型調(diào)控向胚胎型調(diào)控過渡(maternalto-embryonic transition，MET)，MET在不同的物種發(fā)生的時期并不相同，如小鼠MET發(fā)生在2-細(xì)胞期，人MET在4-到8-細(xì)胞期。早期胚胎發(fā)育遺傳程序中仍有大量基因的表達(dá)差異尚未發(fā)現(xiàn)，因此，RNA-Seq技術(shù)在篩選更多胚胎發(fā)育調(diào)控相關(guān)基因以及研究MET調(diào)控上有巨大潛力。

5.胚胎基因其他研究：SNP在生物體胚胎發(fā)育的不同階段中普遍存在。轉(zhuǎn)錄組測序可以分析SNP、微小RNA(microRNAs，miRNAs)及長片段非編碼RNA(lncRNAs)。miRNAs/lncRNAs表達(dá)及多態(tài)性與早期胚胎發(fā)育和著床的關(guān)系逐漸引起關(guān)注，但采用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對其研究較少。miRNAs在多種生物學(xué)過程中具有調(diào)控作用，包括細(xì)胞增殖、分化和凋亡以及胚胎發(fā)育和著床[31]。研究發(fā)現(xiàn)miRNAs編碼區(qū)SNP可能會干擾成熟miRNAs的表達(dá)，引起胚胎發(fā)育異常，增加復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)[32]。另外，研究者利用RNA-Seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)在早期胚胎發(fā)育的過程中l(wèi)ncRNAs發(fā)揮了重要的相關(guān)調(diào)控功能[33]。

RNA-Seq可以對胚胎發(fā)育細(xì)胞通路進(jìn)行廣泛的研究。研究發(fā)現(xiàn)在早期胚胎發(fā)育過程中剪接體通路和內(nèi)吞作用通路與胚胎母源RNA降解和基因組的啟動有關(guān)[34]，細(xì)胞因子及其受體相互作用通路在早期胚胎的發(fā)育和植入過程中發(fā)揮重要作用。胚胎植入反復(fù)失敗的婦女子宮內(nèi)膜中有許多mRNA表達(dá)異常，其中表達(dá)下調(diào)的多數(shù)mRNA都涉及細(xì)胞因子及其受體相互作用通路[35]。

三、小結(jié)與展望

隨著高通量測序技術(shù)快速的發(fā)展，更多的研究人員將其作為工具來挖掘人類不孕不育基因組資源，其高通量的優(yōu)勢極大地促進(jìn)人類不孕不育的研究。此外，與外顯子或基因組的高通量測序相比，轉(zhuǎn)錄組測序具有明顯的優(yōu)勢，可以定量揭示基因調(diào)控以及表觀遺傳變異引起的基因表達(dá)缺陷，也可以分析SNP及調(diào)節(jié)通路，而這些基因調(diào)控超出了DNA測序的檢測范圍。轉(zhuǎn)錄組分析既可探究無精子癥患者差異表達(dá)基因，挖掘更多與精子成熟、運(yùn)動和貯存密切相關(guān)的功能基因，也可以研究輔助生殖中卵母細(xì)胞成熟、受精卵發(fā)育和著床等相關(guān)的表達(dá)基因及其表觀遺傳。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的運(yùn)用成熟更是為輔助生殖研究提供了便捷。

怎樣更好地將高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)應(yīng)用在人類不孕不育研究中？如何很好地發(fā)揮出轉(zhuǎn)錄組測序的優(yōu)勢？如何發(fā)掘出特殊的基因并預(yù)測其功能？這一系列問題都將是在人類不孕不育轉(zhuǎn)錄組研究中所要重點(diǎn)考慮的。