G蛋白偶聯受體的研究進展＊

李聰慧，崔詩遙，顧燕燕，解鴻青，屠振力，時連根

（浙江大學 動物科學學院，浙江 杭州 310058）

1 G蛋白偶聯受體的特性與種類

1.1 G蛋白偶聯受體的特性

G蛋白偶聯受體（G protein coupled receptor，GPCRs）是一類高度保守、存在于細胞表面的膜蛋白超級家族，其數目和種類在細胞表面受體中為最多。在從低等真菌到高等哺乳動物的生物體中，廣泛存在有GPCR，它通過與G蛋白的偶合來調節胞內相關酶的活性，以此產生第二信使而將配體信號從胞外跨膜傳遞到胞內，使細胞的功能活性發生改變，最終對生物體的生長發育、生殖、滯育、攝食、代謝以及行為等起到調控作用。

GPCR由一條肽鏈組成，包含七個α螺旋跨膜結構域，這七個α螺旋跨膜結構域將受體分割為胞外N端、3個胞外環、胞內C端和3個胞內環。受體的胞外部分常帶有糖基化修飾，胞外環上存在的兩個高度保守的半胱氨酸殘基，可以通過形成二硫鍵對受體空間結構起穩定作用。在受體的C端和連接（從肽鏈N端數起）第5和6個跨膜螺旋的胞內環（第3個胞內環）上，都有與G蛋白、GRKs、arrestin等下游信號分子結合的位點［1］。

1.2 G蛋白偶聯受體的分類

根據GPCR氨基酸序列的保守性及結構特征，將GPCRs分為如下4個亞家族［2］：

1.2.1 A族受體

是目前已發現的最大的一類GPCR，含有大量的保守氨基酸，且在第一、二個胞外環之間由二硫橋連接。大多數受體的C端尾含有棕櫚酰化的半胱氨酸（Cys），錨定于膜上。它的配體主要有生物氨基酸及核苷、多肽等。此類受體包括神經肽受體、視覺色素受體等。

1.2.2 B族受體

有相對長的氨基端，含有一些Cys位點，可以形成二硫鍵，形態類似于A族受體，但不含棕櫚酰化位點。主要配體有降鈣素、胰高血糖素、副甲狀腺素、利尿素等。

1.2.3 C族受體

有長的氨基端及羧基端，除ECL1、ECL2的兩個亮氨酸形成二硫橋結構外，C族受體不含A、B族受體的特征。主要包括谷氨酸鹽受體、γ-氨基丁酸受體、Ca2+受體等。

1.2.4 F/TAS族受體

N端較長，結合Wnt糖蛋白。此類受體主要是味覺受體。

2 G蛋白偶聯受體的信號轉導機制

經典理論認為，GPCR被配體激活后，構象發生變化，然后與一種特異的三聚體G蛋白相偶聯。三聚體G蛋白由α、β、γ亞基組成，活化受體使得與α亞基結合的GDP轉化為GTP，并導致α亞基與β、γ亞基分離，受體偶聯的Gα以及分離的Gβ、Gγ分別引發不同的胞內效應體系，從而傳導配體信號。信號傳導結束后，α亞基上的GTP酶水解GTP為GDP，α亞基重新與β、γ亞基親和形成三聚體G蛋白，復位等待下次信號轉導［3］。Gα是信號傳導過程中重要的一環，Gβ、Gγ主要參與下游的信號調節［4，5］。

配體和受體結合后所引發的胞內效應體系主要有以下3種：

2.1 PKA途徑

活化后的Gα（Gαs/Gαi/o）調節細胞膜上的CA（Adenylate Cyclase，腺苷酸環化酶）活性，活化/抑制胞內ATP（Adenosine Triphosphate，三磷酸腺苷）轉化為 cAMP（Cyclic Adenosine Monophosphate，環磷酸腺苷），cAMP作為胞內第二信使物質，調節cAMP依賴的PKA（Protein Kinase A，蛋白激酶A）活性，接著采用磷酸化/去磷酸化的方式，對生物代謝通路、基因表達等多種效應機制進行調控［6］。

2.2 PLC途徑

活化的Gα（Gαq）與膜上的肌醇PLC（Phospholi?pase C，磷脂酶C）偶聯，催化pIp2（Phosphatidylinosi?tol diphosphate，磷脂酰肌醇二磷酸）水解產生IP3（Inositol trisphosphate，三磷酸肌醇）和DAG（Diacyl?glycerol，甘油二酯）。IP3與細胞內質網上的IP3受體結合，打開Ca2+通路，使內質網中的Ca2+釋放到胞漿中，Ca2+也作為胞內第二信使物質，調節胞內各種酶的活性。DAG則與Ca2+以及結合在細胞膜內側的磷脂一起，激活PKC（Protein Kinase C，蛋白激酶C），PKC激活胞漿中的促有絲分裂蛋白激酶，參與下游的信號調節［7］。

2.3 受體門控離子通道途徑

活化的Gα（多為Gαi/Gαo）導致內向整流K+（GIRKs）通道開放，或抑制電壓門控Ca2+通道。同時，Gβ、Gγ也參與GIRK通道的相關活化［8］。

GPCR的活性可以通過脫敏、復敏等來調節。受體脫敏的經典模型主要包括三種機制：受體在蛋白激酶作用下磷酸化后，與其相應的G蛋白不匹配；β-arrestin、GRK介導的質/膜受體內化；受體mRNA含量下降，通過減少合成量及降解已有受體的方法來導致胞內受體組成下降。失活的受體也可通過去磷酸化、溶酶體內加工等方式復敏，重新定位于膜上［9］。

3 G蛋白偶聯受體用于藥物作用靶標

GPCR是跨膜蛋白受體的一個大家族，目前已發現涉及感覺、化學、刺激等成員800多個。在生長、發育、生殖、滯育、神經、精神等生命活動以及內分泌、代謝等生理過程中均有GPCR參與，同時糖尿病、心臟病、腫瘤、免疫與感染性疾病、神經與精神性疾病等的發生、發展、治療效果也與GPCR密切相關。為此，GPCRs成為了當前最為重要的藥物作用靶標庫。根據最新的統計數據，美國食品樣品監督管理局（FDA）批準上市的藥物中共有475種藥物靶向GPCRs，約占FDA批準藥物的34%；2011～2015年間，GPCRs藥物銷售額達9170億美元，銷售份額占全球總額的約27%；統計獲批藥物和臨床候選藥物作用靶點時，發現胺類受體如組胺受體、多巴胺受體、腎上腺受體、乙酰膽堿受體等為最大的藥物靶點，475種獲批藥物中的314種作用在該類受體上。

目前新藥開發的主要思路是篩選能抑制有害信號傳遞的物質，例如：治療慢性心臟衰竭的Meto?prdol是一個針對β1視紫質的反激動劑，治療神經分裂癥的Clozapine是一種反激動劑［2］。藥物開發過程往往從一個與疾病相關的GPCR入手，尋找該通路的一些阻斷、激活分子，即找到新受體及其與疾病的關系，是開發新藥的先決條件。然而，由于有很多的代償途徑同時存在于人體內，并且某個生理效應可以由不同的受體所引發，所以將GPCR與疾病匹配還有許多難題。此外，雖然體外實驗積累了大量的數據，但是藥物作用的是一個復雜的機體，需要有體內實驗的可靠證據才可以投入使用，同時需要大量的動物缺失突變的模型來證實GPCR與疾病的關系［10］。

4 G蛋白偶聯受體研究的熱點

4.1 G蛋白偶聯受體功能篩選平臺

利用生物信息學的手段對日益充實完善的基因組數據庫進行分析，再以分子生物學方法克隆出許多GPCR基因，但為其匹配的相應激動劑、拮抗劑的研究相對滯后。目前已經建立的激動劑、拮抗劑篩選平臺主要有以下幾種［11］：

4.1.1 鳥苷酸結合實驗

該平臺用于檢測在激動劑作用下與膜上GPCR結合的［35S］GTPγS。Larsen等用此方法在CHO細胞系上鑒定了果蠅中的兩個Allatostatin受體（DAR-1和DAR-2）［12］。該平臺的優點是：位于信號傳導途徑的上游，干擾因素較少。缺陷是：只對Gαi/o偶聯的受體比較靈敏，原因是該類受體GTP/GDP變化最快，量最大；實驗要求分離自由態/結合態的［35S］GTPγS，具有放射性的危險。

4.1.2 cAMP實驗

該平臺基于對整個細胞內cAMP的測量以及細胞膜上腺苷酸環化酶活力的測定，比較適用于Gαs偶聯的受體，但對于Gαi/o偶聯的受體需要用福斯高林（一種腺苷酸環化酶激活劑）進行預處理。Beggs等利用這種方法鑒定了一個從蜜蜂中克隆到的D1型多巴胺受體，發現其有組成型活性［13］。

4.1.3 磷酸肌醇（IP）累積實驗

該平臺適用于Gαq偶聯的GPCR的篩選。之前有利用IP3結合蛋白來測定IP3含量的模型，盡管此方法孵育時間短，但信/噪比高。所以，目前人們用IP1抗體來檢測IP1的累積。Trinquet等建立了一種基于D-myo-inositol 1 monophosphate的HTRF模型，與IP模型、Ca2+遷移模型比較，證明該模型是可行的［14］。

4.1.4 胞內Ca2+實驗

GPCR信號傳遞過程中往往伴隨著Ca2+的遷移，該平臺基于這種現象而建立。如水母發光蛋白在腔腸素存在時，能通過發熒光指示胞內Ca2+的濃度變化。Radford等利用這個原理，在S2細胞中表達水母發光蛋白的讀碼框，檢測到Anopheles中白細胞激肽的受體［15］。隨著高通量檢測技術的發展，使用Ca2+敏感性染料，以實時電偶儀（CCD）為基礎的熒光板閱讀器（FLIPR），自動完成對Ca2+積累、胞外Ca2+進入、內質網Ca2+釋放的測量［16］。

4.1.5 報告基因表達實驗

該平臺是利用活化的第二信使激活報告基因的啟動子來進行檢測的，目前被利用的報告基因有β-半乳糖苷酶、熒光素酶、綠色熒光蛋白等。Hearn等用熒光素酶報告基因的方法，鑒定了一種多選擇性剪切的果蠅多巴胺型受體［17］。盡管已有1536孔自動檢測儀用于檢測目的基因的表達，但該平臺的處理時間較長，并且對下游產物的檢測易產生假陽性現象。

4.2 G蛋白偶聯受體的非放射性實驗

雖然放射性標記的靈敏度高，但存在放射性的危險。因此，人們嘗試著將放射性標記更換為熒光標記。通過熒光標記技術對受體進行實時的胞內定量、定位分析、結構解析等，是當前研究的熱點之一。但熒光標記有可能改變信號分子受體的藥理學效果，使體外實驗不能反映出體內的實際情形。同時，異源表達也可能會引發表達水平低、缺少互作蛋白、重復性低等許多問題。為此，建立起高通量、不含放射性、快速、精確、全面的篩選模型，是當前藥物篩選開發的一個重要研究目標。

4.3 G蛋白偶聯受體二聚化現象

GPCR尤其是結構相似的GPCR，其異源二聚化現象很常見，例如C族GABAR88與味覺受體二聚化，B族降鈣素受體樣受體與RAMP二聚化等。二聚化可能改變受體的藥理學特性，例A族共表達的δ、μ-阿片受體，使得它們不能與任一單一配體結合，但在兩種配體同時加入時引發了強烈的陽性反應。有學者認為，受體二聚化可能是GPCR與三聚體G蛋白偶聯的條件。但也有學者認為，受體二聚化可能是體外實驗時受體在細胞中過表達所形成的假象［2］。

新興技術BRET（生物發光共振能量轉移）和FRET（熒光團共振能量轉移），已經被用于受體二聚化問題的研究。該二項技術的原理是：當兩種物質的距離足夠接近時，部分能量（熒光能/生物光能）能從供體轉移給受體。FRET依賴外源光的激發，BRET的供體熒光是熒光素酶氧化底物而發生的，均可用于考察蛋白質間的相互作用，被廣泛地應用于GPCR的二聚化研究領域［18］。Berthouze等利用BRET技術，發現5HT4受體的TM3與TM4間形成二硫橋的兩個Cys位點對其同源二聚化非常重要［27］。Hamdan等用BRET技術檢驗12種GPCR內吞時，發現10種受體發生了β-arrestin與β2-adaptin的結合［19］。

4.4 G蛋白偶聯受體的結構研究

分析已解析的GPCR二級結構，可以將GPCR蛋白分子劃分成3部分：①胞外區，包含N端和3段胞外環區；②跨膜區，包含7段跨膜α螺旋；③胞內區，包含3段胞內環區、胞內第8根螺旋和羧基端（C端）。胞外區域負責識別信號分子，跨膜區形成整個蛋白的骨架并負責結合配體、傳遞信號，胞內部分與G蛋白、GRKs、arrestin等下游效應分子結合以傳遞信號。GPCR的三維結構解析，對于理解GPCR的信號轉導機制和基于其結構的藥物設計具有十分重要的意義。但GPCR是跨膜蛋白，因此不易得到晶體，難以用X射線、NMR等方法測定其三維結構。所以直到2000年才由Palczewski等從天然組織中提取牛視紫紅質蛋白，與11-順式-視黃醛復合后得到復合晶體，從而解析出第1個GPCR的三維精細結構［20］。當前獲得高質量GPCR蛋白晶體的方法主要有三種：缺失（或點）突變法、融合蛋白法和盒式突變法。2007年Rosenbaum研究團隊利用體外重組技術表達純化了人β2腎上腺素受體，并采用缺失（或點）突變法結合融合蛋白法，將影響蛋白穩定性的氨基酸或氨基酸片斷刪除掉，同時將胞內第3個柔性loop與抗體Fc片斷相融合，第一次獲得了穩定的人β2腎上腺素受體晶體，從而解析出其3.7?的精細結構［21，22］，該成果成為當年世界十大科技進展之一。Warnel等也采用點突變不穩定氨基酸以及缺失突變較長N末端、較長C末端、胞內loop，于2008年獲得了穩定性高的火雞β1腎上腺素受體突變體，并解析出其2.7?的精細結構［23］。盒式突變法是將GPCR蛋白跨膜螺旋表面的多個疏水殘基用親水殘基漸進式定點替換，以獲得形態相似、功能相同、水溶性的GPCR蛋白突變體，從而進一步解析出其精細結構。盒式突變法目前還處于探索階段，至今還沒有用該方法成功解析出GPCR蛋白精細結構的結果報道。缺失（或點）突變法、融合蛋白法和盒式突變法均或多或少地改變了原始蛋白的一些結構，以此解析出的晶體結構可能與其實際結構存在一定的差別，但這并不會影響我們在更多了解GPCR蛋白結構與功能的關系中，獲取重要、有用的參考資料。