上皮細胞間質轉化促肺纖維化機制及藥物干預治療的研究進展*

王 源，李萬成

成都醫學院第一附屬醫院 呼吸內科 (成都 610500)

肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是各種間質性肺疾病(如過敏性肺炎、石棉沉著病、 肺淋巴平滑肌瘤病)的最終病理表現[1]。其中，上皮細胞間質轉化(epithelial to mesenchyma transition，EMT)被認為在PF發生發展過程中發揮著重要作用[2]。EMT是指在特定的生理及病理條件下，上皮細胞失去極性，上皮細胞形態改變，上皮細胞標志物E-鈣粘素(E-Cadherin)等丟失或表達下調，間質細胞標記物如α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)表達上調，最終使得細胞黏附能力減弱，增殖和遷移能力增強[3]。在 PF病理過程中，EMT的發生發展受到多種細胞內信號轉導通路的調控，多種抑制或逆轉EMT的藥物有利于改善PF，其有望成為PF藥物治療的重要研究方向。

1 EMT參與調控PF的相關信號通路

1.1 Wnt信號通路

目前，發現Wnt信號通路主要有3條傳導途徑，包括經典通路: Wnt /β-鏈蛋白(β-catenin)信號通路，非經典傳導通路: Wnt /JNK 信號通路和Ca2+介導的Wnt /Ca2+途徑[4]。 研究[5]發現，包括有Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a在內的19種Wnt蛋白，其中參與 Wnt經典信號通路的種類有 Wnt2、Wnt3、Wnt8b 等，而參與非經典信號通路的種類有Wnt6、Wnt7b、Wnt10a等。經典的Wnt/β-catenin信號通路是調控 EMT 發生發展的重要信號通路。其構成包括: 分泌蛋白Wnt家族，分泌型卷曲蛋白相關蛋白( secreted frizzled-related protein， sFRP) 、家族蛋白激酶 2A(protein phosphatase 2A，PP2A)、跨膜受體(Frizzled 家族分子 Fz)、酪蛋白激酶(casein kinase 1，CK1)、Dickkopf 蛋白( DKK) 家族、糖原合成酶激酶-3β( Gsk-3β)、β-catenin以及結腸腺瘤息肉蛋白 (adenomatous polyposis coli，APC)[6]。其調控機制為:1)當Wnt被激活時,Wnt受體Fz的胞外區與 Wnt 結合，通過下游信號傳導，使得β-catenin 無法在細胞質中被降解，此時β-catenin作為運載體介導E-Cadherin與α-catenin 形成復合物，抑制E-Cadherin活性表達；2)積聚到一定程度后，β-catenin發生核轉位，與核內轉錄因子(TCF /LEF) 形成復合物，激活下游靶基因如 Snail、Slug轉錄，進而促進 EMT 發生[7]；3)Wnt信號活化后，抑制GSK-3β活性，使得β-catenin分解減弱，高濃度的β-catenin將誘導細胞形態改變，從而調節EMT[8]。

1.2 Rho-Rock 信號通路

Rho-Rock 信號通路是機體各器官組織中普遍存在的一條信號轉導通路。Rho家族蛋白具有三磷酸鳥苷 (guanosine triphosphate, GTP)酶活性，又稱為Rho GTPase，屬于Ras超家族中的GTP結合蛋白。在哺乳動物細胞內，存在有20余種不同Rho蛋白。Rho在細胞內與GDP/GTP結合態之間相互轉化[9]。目前，研究[10]認為，Rho家族蛋白，通過介導細胞內信號通路，影響細胞骨架形成，改變細胞形態，影響細胞增殖、黏附能力，進而發揮其多種生物學效應。Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho associated coiled coil forming protein kinase，Rock)為Rho下游靶效應分子，接受Rho傳遞的活化信號，完成自身氨基酸結構域磷酸化改變，介導下游一系列磷酸化/脫磷酸化反應過程，從而影響細胞形態及功能。

1.3 TGF-β/Smads通路

TGF-β超家族包括25 種相關蛋白，主要包括 TGF-βs、活化素(activins)、抑制素(inhibins)、生長分化因子(growth differentiation factors，GDFs)等，在胚胎發育、細胞分裂、器官形成、組織修復等方面發揮重要作用。TGF-β為其中最重要亞型，在多種器官組織中表達，可由內皮細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞、成纖維細胞等分泌，起著細胞分裂、增殖、分化、凋亡、遷移、刺激細胞外基質 (extracellular matrix, ECM)產生和促使ECM 降解等廣泛的生物學作用[11]。

TGF-β受體( transforming growth factor-β receptor，TβR)廣泛表達于各種組織中，TβR有3 種亞型(TGF-β1、TGF-β2 、TGF-β3型)，其中β1型和β2型為信號傳遞受體，其結構由膜外區、跨膜區和膜內區組成[12]。TβR膜外區均富含半胱氨酸[13]，被活化的TGF-β與TGF-β2結合后，磷酸化TβRI的甘氨酸-絲氨酸富集區域(GS序列)與配體結合，從而將生物信息向下游傳導[14]。

Smad蛋白為 TGF-β 超家族轉錄協調因子，存在于細胞質當中，介導TGF-β 信號傳導到細胞核。目前，研究[15]發現，細胞內存在有9 種Smads 蛋白，分為3大亞型：1)膜受體調控型 Smads(R-Smads)，包括有Smad1、Smad2、Smad3、Smad5 和 Smad8，其中 Smad2 和 Smad3 與 TGF-β1結合，形成轉錄復合體，與下游靶基因的特定部位結合，參與TGF-β 信號轉導；2)共同通路型 Smads(Co-Smads)：Smad4、Smad10, 其中Smad4 與R-Smad 結合后形成異源復合物，進入細胞核參與調節轉錄；3)抑制型Smads(I-Smads)：Smad 6、Smad 7，對 TGF-β1 信號轉導通路起負性調控作用。TGF-β 信號通路包括經典Smad信號通路和非經典Smad 信號通路。經典Smad信號通路是TGF-β發揮致纖維化作用的主要途徑，TGF-β其他信號通路包括絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路、JNK、PI3K激酶等。經典Smad信號和非Smad信號轉導之間相互作用影響。

2 抑制或逆轉EMT為治療靶點的藥物

2.1 Wnt 通路抑制劑

Wnt 信號通路抑制劑在治療PF中發揮重要作用，主要機制為阻斷Wnt 信號通路激活及抑制下游信號通路的傳導。Wnt 信號通路的抑制劑包括分泌蛋白家族 (the secreted frizzled related proteins，sFRp)、Wnt 抑制蛋白(wnt inhibitory protein，WIF)、Wnt ibitoryfactor-1(WIF-1)、Cerberus(CER)、Dickkopf(Dkk)蛋白家族。 Dkk-1 為 Dkk 蛋白家族中一員，是一種 LRP5/6 拮抗配體。Sun等[15]研究發現，Dkk-1 可以抑制 Wnt/β-catenin 信號傳導通路，促使肺間充質干細胞向上皮細胞轉化，修復受損的肺上皮細胞，延緩大鼠肺纖維化進程。依那西普是人源腫瘤壞死因子(TNF-α)拮抗劑，它被廣泛用于風濕性疾病，是炎癥因子靶點。動物模型研究[16]顯示，給予依那西普干預后，與對照組相比，實驗組小鼠Wnt1、Wnt3a、Wnt4表達下調，表明依那西普可以抑制PF進展。在博來霉素導致PF模型中，以馬提尼是一種酪氨酸激酶抑制劑，可減少β-catenin表達，上調GSK-3β表達，從而抑制纖維化發生[17]。Tang等[18]研究吡非尼酮治療PF，結果顯示，治療后肺間質炎癥細胞計數下降，浸潤面積縮小，肺泡灌洗液中IL-1 、SMA、Fn、FSP1 等標志物濃度下降，PF癥狀明顯改善。

2.2 Rho-Rock 信號通路抑制劑

張冬梅等[19]研究結果顯示，丹參酮ⅡA 可緩解 BLM 誘導的肺組織膠原蛋白沉積和M2型巨噬細胞浸潤，增加肺組織上皮E-cadherin表達，降低肺成纖維細胞和肌成纖維細胞 Rho A、Rho C、Rock1水平，表明丹參酮ⅡA可通過阻斷 Rock信號通路的活化，抑制肺纖維細胞增殖和活化，減少ECM沉積，緩解BLM所致的大鼠PF改變。此外，Jiang 等[20]通過建立BLM誘導PF模型發現，法舒地爾是一種人工合成的異喹啉磺胺衍生物,可通過抑制Rho/Rock信號通路的激活改善博來霉素導致的PF小鼠肺泡炎性滲出程度。解宏權[21]發現，TGF-β1誘導肺成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，體外培養細胞液中RhoA、RhoC、Rock1表達豐度增加，1型膠原、LN和FN大量沉積，而用絲/蘇氨酸激酶抑制劑(TGF-β/Smad)處理后，RhoA、Rock1、Smad2 mRNA 表達下降，說明TGF-β1可介導Rock信號轉導通路的活化，表明兩條信號通路之間存在交叉作用。在博來霉素致PF模型中，Y-27632(Rock特異性抑制劑)作用于Rho/Rock 信號通路，抑制肺成纖維細胞遷移，減少肺組織ECM沉積，從而改善博來霉素導致的肺成纖維細胞增生和膠原蛋白沉積[22]。

2.3 TGF-β/Smads通路抑制劑

2.3.1 藥物治療 TGF-β通路在PF產生發展中起重要作用。吡非尼酮是一種人工合成的吡啶酮化合物。體內外實驗研究[23]表明，吡非尼酮通過抑制TGF-β活化而發揮抗炎、抗纖維化作用，是目前被批準用于臨床治療特發性PF(idiopathicpulmonary fibrosis，IPF)的藥物。吡非尼酮抗纖維化具有廣譜性，尤其對PF、腎小球纖維化具有明顯治療效果，因其具有良好的安全性和耐受性，是改善IPF患者臨床癥狀的靶向藥物之一[24]。Chen等[25]實驗結果表明，實驗組加入吡非尼酮后可有效減少TGF-β1 誘導的細胞內 FN1、HSP47 mRNA 和HSP47蛋白表達量，減少了細胞外基質過度沉積。同時證明，吡非尼酮可以抑制TGF-β1誘導的肺上皮細胞向間質細胞轉化。尼達尼布是另一種TGF-β抑制劑，通過與生長因子受體三磷酸腺苷競爭性結合，抑制肺間質成纖維細胞增殖、分化、遷移。Wollin等[26]研究表明，尼達尼布抑制肺成纖維細胞增殖，減少α-SMA 表達量，緩解炎癥纖維化程度，改善患者預后。Wuyts等[27]研究發現，阿奇霉素不僅能夠明顯減少肺組織膠原蛋白、羥脯氨酸含量 ，而且可增加大鼠肺活量，改善大鼠肺通氣，其機制可能與下調β-catenin 表達有關。Xiang 等[28]研究發現， 使用新對葉百部堿干預博來霉素(bleomycin， BLM)，誘導VC，可降低膠原Ⅰ、α-SMA和 TGF-β1水平，且TGF-β1水平與新對葉百部堿濃度呈劑量依賴關系。維生素D治療可減少肺組織中羥脯氨酸含量，減少促纖維因子TGF-β表達，抑制肺間質成纖維細胞活化，阻斷EMT發生，有效緩解BLM誘導的PF[29]。秦靜等[30]研究顯示，早期應用丹參素可以增加肺組織超氧化物歧化酶活性，減少丙二酸、羥脯氨酸含量，減輕博來霉素誘導的大鼠PF程度。其可能機制為下調TGF-β1、Smad3 mRNA和促進Smad7 mRNA的表達。

2.3.2 基因及細胞因子治療 miR-326首次發現其高表達在神經元，具有抗神經衰老作用。在NIH/3T3細胞(小鼠胚胎成纖維細胞)研究[31]中發現， miR-326通過影響TGF-β1表達，上調MMP-2、MMP-9等抑纖維化基因表達。說明miR-326可以抑制TGF-β1活性，控制細胞形態改變，作為一種新型的抗纖維制劑。miR-21是最早發現的一種致癌性miRNA，可以影響包括PTEN基因在內的多種腫瘤抑制基因活性。最近，在IPF小鼠的肺肌成纖維細胞中發現，miR-21表達是高度上調的。Yang等[32]在博來霉素誘導的小鼠PF中發現，應用miR-21抑制劑下調TGF-β1誘導的COL1、COL3和α-SMA的表達。用miR-21前體干預TGF-β1作用的MRC5細胞，發現誘導FN、α-SMA轉錄，尤其是誘導Smad2磷酸化和Smad7表達減少，說明miR-21在PF中也起到重要作用。基質金屬蛋白酶(matrix metal-loproteinases，MMPs)/金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of metallopmteinase，TIMPs)是降解ECM、抑制促炎因子表達和減輕PF程度的一類重要蛋白酶。其表達受多種細胞因子調控，如TGF-β下調MMP-1、 MMP-3和TIMP-2表達，促進MMP-2和 TIMP-1表達。研究[33]發現，MMP-2和TIMP-1主要降解Ⅳ型膠原、α-SMA、波形蛋白等細胞外基質，而肺基膜的損傷則可促進PF發展。肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)是作為一種能刺激肝細胞增殖的物質而被提純發現，是一種能刺激多種細胞生長、增殖以及分化的多功能細胞因子，HGF可以抑制TGF-β的表達，通過減少ECM產生和促進降解，進而減輕BIM誘導PF小鼠呼吸困難癥狀[34]。

3 小結

PF是各種慢性肺部疾病的終末期病理改變，目前仍無有效治療藥物。各種細菌、真菌、病毒感染、化學中毒、免疫損傷等物理、化學因素，使肺泡組織增殖、分化受到影響，肺泡上皮細胞發生形態改變，轉化為肺成纖維細胞，成為ECM的重要來源。多種信號通路相互作用，共同參與EMT的發生、發展，明確EMT具體發生機制，研究針對不同信號通路的靶向藥物，成為治療PF藥物遴選和研發的重要研究方向。目前，EMT機制研究還僅限動物實驗研究，其具體機制未完全闡明，需要進一步研究，以研發更具有療效的抗纖維藥物。