微纖維蛋白相關糖蛋白2在結直腸癌組織中的表達變化及意義

陳歡，蔡小旭，劉志清

(三峽大學人民醫院·宜昌市第一人民醫院，湖北宜昌443000)

微纖維蛋白相關糖蛋白2(MAGP2)是一種相對分子質量為25 kD，主要定位于細胞外基質(ECM)的蛋白，其N端的RGD結構域能夠與ECM中的彈性纖維等分子發生交聯，調節ECM的結構和功能，介導細胞的黏附和運動[1]。MAGP2是ECM影響細胞內信號轉導的關鍵媒介分子，尤其能在不同類型細胞中特異性地激活或抑制Notch信號通路[1～3]。MAGP2已被證實與多種腫瘤(舌癌、乳腺癌、膽管細胞癌)的發生發展有關[4～8]。結直腸癌(CRC)是消化系統腫瘤主要類型，近年來在我國居民中的發病率逐漸攀升[9]。尋找新的CRC標志物，可能會為CRC提供新的診治靶點。MAGP2在CRC組織中的表達變化國內外尚未見報道。本研究探索MAGP2在正常結直腸組織和CRC腫瘤組織中的表達差異及意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年7月～2018年1月本院病理科留存手術切除的CRC組織及其正常結直腸組織50例份，均經病理檢查確診，術前均未接受放化療。其中CRC患者男35例、女25例，平均年齡54.2歲，結腸癌取材48例、直腸癌取材12例。對患者進行隨訪，統計5年生存率。本研究經醫院倫理審查委員會批準，并獲得豁免知情同意文件。

1.2 CRC組織與正常結直腸組織中MAGP2蛋白表達檢測 采用免疫組化法。石蠟切片、脫蠟、水化后，用PBS緩沖液(湖北百奧斯生物科技有限公司)洗2次(每次5 min)，用蒸餾水或PBS緩沖液配置新鮮的3% H2O2，室溫封閉5～10 min，用蒸餾水洗3次進行抗原修復。之后再用PBS緩沖液漂洗5 min，滴加山羊血清封閉液(湖北百奧斯生物科技有限公司)，室溫封閉20 min，甩去多余液體。一抗(MAGP2抗體，Abcam，1∶1 000)室溫孵育1 h。之后吸去一抗，用PBS緩沖液洗3次，每次2 min。用二抗(湖北百奧斯生物科技有限公司)室溫孵育20 min。PBS洗3次，每次2 min，滴加試劑SABC，室溫靜止20 min。之后PBS緩沖液洗凈后用DAB(湖北百奧斯生物科技有限公司)顯色。脫水、透明、封閉、鏡檢。根據染色強度分為強陽性、弱陽性、陰性。強陽性為高表達，弱陽性、陰性為低表達。

1.3 CRC組織與正常結直腸組織中MAGP2 mRNA表達檢測 采用RT-PCR法。用TRIzol(Invitrogen)法提取各組細胞總RNA，逆轉錄獲得cDNA(Bio-Rad)。設計并合成目的基因和內參的引物后，使用無RNase 的雙蒸水將引物稀釋至10 μmol/L，之后建立25 μL 的PCR反應體系：cDNA 4 μL，正向引物(深圳華大基因股份有限公司)1 μL，反向引物(深圳華大基因股份有限公司)1 μL，2×SYBR Green master mix(湖北百奧斯生物科技有限公司)12.5 μL，用無RNase 的雙蒸水將反應體系調整至25 μL，上機(Bio-Rad)進行實驗。MAGP2正向引物5′-AACTTAAGCTTGGTACATGTCGCTCTTGGGACC-3′，反向引物5′-GCCACTGTGCTGGATTCACAGACCATTGGGTCTC-3′；β-actin正向引物5′-CATTAAGGAGAAGCTGTGCT-3′，反向引物5′-GTTGAAGGTAGTTTCGTGGA-3′。PCR反應體系：90 ℃預變性5 min；90 ℃變性15 s，65 ℃退火15 s，75 ℃延伸15 s，40個循環；75 ℃再延伸5 min。數據分析采用2-ΔΔCt法。mRNA相對表達量上調2倍為表達上調[10]。

1.4 統計學方法 采用GraphPad Prism 7軟件。計數資料比較采用χ2檢驗；預后分析采用Log-rank法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CRC組織與正常結直腸組織中MAGP2表達比較 CRC組織內MAGP2蛋白定位于ECM，且呈強信號，正常結直腸組織內未見明顯MAGP2表達。CRC組織中MAGP2蛋白高表達81.7%(49/60)，低表達18.3%(11/60)；正常結直腸組織中MAGP2蛋白低表達13.3%(8/60)，無高表達。CRC組織中MAGP2蛋白表達與正常結直腸組織比較差異有統計學意義(P<0.05)。隨機選擇CRC組織與正常結直腸組織各10例，CRC組織中MAGP2 mRNA表達上調占90%(9/10)。

2.2 MAGP2蛋白高表達與CRC患者臨床病理特征的關系 MAGP2蛋白高表達的CRC患者Dukes分期高(P=0.048)、腫瘤分化水平低(P=0.034)、伴淋巴結轉移(P=0.036)。見表1。

2.3 MAGP2蛋白表達與CRC患者預后的關系 MAGP2蛋白低表達患者的5年生存率為64%(7/11)，而MAGP2蛋白高表達患者的5年生存率為53%(26/49)，比較差異有統計學意義(P<0.001)。

3 討論

MAGP2的突變或異常表達與人類多種疾病相關，MAGP2的突變可能影響血管彈性纖維的功能，參與主動脈夾層形成的病理過程[10]；MAGP2在脂肪組織中可能扮演了ECM重塑和炎癥調控的角色，參與了肥胖和多種代謝相關疾病的發生[11,12]。

腫瘤微環境可與腫瘤細胞相互作用，為腫瘤細胞增殖和轉移提供適合的環境。腫瘤微環境中的ECM被認為是細胞生命活動的動態調節器。ECM通過以下機制影響細胞過程。一方面ECM可調控腫瘤微環境中各類分子配體、生長因子、細胞趨化因子及基質降解酶的濃度和活性[13，14]；另一方面，ECM蛋白質組成和交聯決定了腫瘤微環境的物理性質，如結構、剛性等，這影響了腫瘤細胞增殖和轉移潛能[15～17]。MAGP2是ECM的重要組分，其可能是CRC的癌基因。既往研究發現，MAGP2在舌癌組織中可激活下游MAPK和AKT信號通路，促進腫瘤細胞的惡性表型[6]；MAGP2在乳腺癌組織中能夠調節下游基質金屬蛋白酶2、基質金屬蛋白酶9、焦點黏附激酶、細胞外調節蛋白激酶等通路或分子，促進腫瘤細胞增殖和轉移[4,5]。在CRC組織中，MAGP2也可能介導前述信號通路和分子的激活或表達。Notch是腫瘤組織中常見的異常激活通路，Notch與CRC細胞增殖、轉移、血管生成和耐藥均有緊密聯系[18～21]。雖然目前尚無文獻證實腫瘤組織中MAGP2是否可以調控Notch，但鑒于MAGP2具有調節Notch活性的結構域，MAGP2-Notch軸可能在CRC發生發展中具有重要意義。另外，MAGP2在CRC中的癌基因角色也可能與其調控整合素信號通路相關。整合素是一類廣泛分布于細胞表面的糖蛋白分子，與胞外基質黏附形成黏著斑，為信號蛋白提供信號傳導的結構基礎，與腫瘤生長、侵襲和轉移等過程密切相關[22，23]。有研究表明，MAGP2在內皮細胞中通過RGD結構域與整合素受體結合，調控其下游分子的激活[1，2]。本研究結果顯示，MAGP2蛋白在CRC組織中主要定位于腫瘤間質，其表達高于正常結直腸組織，且其高表達與患者臨床病理特征及預后相關，提示MAGP2可能為CRC的診斷標志物和治療靶點。

表1 MAGP2蛋白高表達與CRC患者臨床病理特征的關系(例)

綜上所述，MAGP2可能為CRC新的診斷標志物和潛在治療靶點。其在CRC惡性表型中的功能和作用機制有待于進一步研究闡明。