p38 MAPK抑制劑對高糖誘導神經母細胞瘤細胞凋亡的作用及機制

劉瑞婷，朱文瑛，張琳，唐躍，曹銘鋒，蔣進皎

(山東大學附屬山東省立醫院，濟南250021)

糖尿病神經病變作為一種常見的糖尿病并發癥，嚴重影響患者的生活質量。早期糖尿病神經病變的研究多集中于糖尿病周圍神經病變，近期研究表明，糖尿病對中樞神經系統同樣存在損傷。研究表明，糖尿病患者可出現記憶力、定向力等認知功能下降，同時可出現人格改變、學習能力下降等[1～4]。目前，糖尿病中樞神經病變的分子機制尚未充分闡明，阻礙了其治療的進一步進展。既往研究表明，糖尿病患者腦神經元凋亡較無糖尿病病史患者明顯增多[5]；糖尿病小鼠模型神經元凋亡較正常對照組增加[6]；高糖處理神經元細胞可促進神經元細胞凋亡的發生[7]。研究結果證實，絲裂原活化蛋白激酶p38 (p38 MAPK)作為細胞凋亡調控密切相關的激酶，在高糖作用下其活性顯著增加[8]。因此認為，高糖環境可能通過調節p38 MAPK活性以調控神經元細胞凋亡。2017年9月～2018年5月，本研究觀察高糖對神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y凋亡及凋亡相關蛋白表達的影響，并探討p38 MAPK在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 SH-SY5Y細胞，購于美國菌種保藏中心。抗磷酸化p38 MAPK及總p38 MAPK均購于美國Cell Signaling Technology公司，抗BAX、BID、BCL-2、BAD抗體均購于中國Proteintech公司，p38 MAPK抑制劑購于美國Sigma公司，Annexin V-PI染色試劑盒購于中國碧云天生物技術公司，ECL顯色液購于美國Millipore公司，胎牛血清購于美國Gibco公司，谷氨酰胺購于美國Sigma公司，青鏈霉素雙抗購于美國Sigma公司。蛋白電泳儀及電泳槽購于美國Bio-rad公司，顯影儀購于美國Thermo公司，熒光顯微鏡購于德國Zeiss公司。

1.2 細胞培養及處理 SH-SY5Y細胞采用含10%的胎牛血清、100 U/mL的青鏈霉素雙抗、2 mmol/L的谷氨酰胺的DMEM高糖培養基，在37 ℃、含5%二氧化碳的孵箱中進行培養。于無血清培養基中培養12 h，隨機進行分組，A、B、C組分別加入45、90、135 mmol/L高糖處理1.5、3、6 h，D、E組分別加入10、25 μmol/L的p38 MAPK抑制劑PD169316預處理30 min，之后加入135 mmol/L高糖溶液培養12 h。對照組僅常規培養不做干預。另隨機選部分細胞用135 mmol/L高糖處理3 h作為高糖對照組。

1.3 細胞內磷酸化p38 MAPK及凋亡相關蛋白檢測 采用Western blotting法。細胞處理后，用預冷的PBS洗滌細胞3次，加入含有PMSF及磷酸酶抑制劑的RIPA，冰上裂解30 min，離心后取上清，BCA法測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液后沸水煮10 min變性。根據蛋白濃度調整上樣量，12%的SDS-聚丙烯凝膠電泳后電轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，PBS洗膜后二抗室溫孵育1 h，采用ECL法顯影。目的蛋白條帶密度與對應內參比較后，以相應對照組的倍數作為目的蛋白相對表達量。

1.4 細胞凋亡檢測 采用Annexin V-PI染色法。細胞處理后，根據試劑盒說明書采用Annexin V-FITC及PI染色，熒光顯微鏡細胞染色情況并拍照。綠色染色代表凋亡早期細胞，紅色染色代表凋亡中晚期及死亡細胞。

2 結果

2.1 高糖對細胞內磷酸化p38 MAPK及細胞凋亡相關蛋白表達的影響 高糖處理1.5 h，與對照組比較，其他各組磷酸化p38 MAPK蛋白相對表達量高(P均<0.05)，而總p38 MAPK蛋白表達變化不大，差異無統計學意義(P均>0.05)；各組BCL-2蛋白相對表達量低，其中C組與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，而BAX、BAD、BID蛋白相對表達量較對照組高，其中B、C組的BAX蛋白，C組的BAD蛋白，B組的BID蛋白相對表達量與對照組比較差異有統計學意義(P均<0.05)。高糖處理3 h，與對照組相比，各組磷酸化p38 MAPK蛋白相對表達量呈濃度依賴性升高(P均<0.05)，而總p38 MAPK蛋白表達變化不大，差異無統計學意義(P均>0.05)。與對照組相比，各組BCL-2蛋白相對表達量呈濃度依賴性降低，但僅C組與對照組差異有統計學意義(P<0.05)；各組BAX、BAD、BID蛋白相對表達量均呈濃度依賴性升高，與對照組相比差異均有統計學意義(P均<0.05)。高糖處理6 h后，與對照組相比，各組磷酸化p38 MAPK蛋白相對表達量呈升高趨勢，其中A組升高更為明顯，而B、C組均較A組低(P均<0.05)。總p38 MAPK在高糖處理后變化較對照組均無統計學意義(P均>0.05)。BCL-2蛋白相對表達量呈濃度依賴性降低，其中B、C組與對照組比較差異有統計學意義(P均<0.05)。與對照組相比，A、B組BAX蛋白相對達量高(P均<0.05)，A、B、C組BAD蛋白相對達量高(P均<0.05)，A組BID蛋白相對達量高(P<0.05)。見表1。

表1 高糖對細胞內磷酸化p38 MAPK及細胞凋亡相關蛋白表達的影響

2.2 p38 MAPK抑制劑對細胞內磷酸化p38 MAPK及細胞凋亡相關蛋白表達的影響 與高糖對照組比較，D、E組磷酸化p38 MAPK蛋白相對表達量低(P均<0.05)，BCL-2蛋白相對表達量高(P均<0.05)，BAD蛋白及BID蛋白相對表達量低(P均<0.05)，E組以上指標變化最明顯(P均<0.05)。見表2。

表2 p38 MAPK抑制劑對細胞內磷酸化p38 MAPK及細胞凋亡相關蛋白表達的影響

2.3 p38 MAPK抑制劑對各組細胞凋亡的影響 根據染色結果與對照組比較，C組細胞凋亡重；與C組比較，E組細胞凋亡輕。

3 討論

作為中樞神經系統的重要組成部分，神經元損害在中樞神經系統的損傷中起重要作用。既往研究表明，高糖環境中培養的神經元細胞可能出現Aβ沉積、突觸數目減少，突觸功能異常等損害[9]；糖尿病動物模型的研究也證實長期高糖可能導致動物發生學習能力減低[10]；流行病學調查證實，糖尿病患者較非糖尿病患者語言學習能力降低[11]，2型糖尿病患者疾病晚期可出現中樞神經系統病變[12]，而早發的1型糖尿病患者可能出現中樞神經系統發育的異常及認知功能減低[2,13]。因此，研究高糖引起神經元損害的機制對高糖引起的中樞神經系統疾病的治療具有極其重要的意義。

p38 MAPK是真核細胞中高度保守的激酶，廣泛分布于全身各種器官及組織。作為壓力激活性激酶，p38 MAPK參與包括細胞凋亡、細胞因子產生、轉錄調節等等在內的諸多調控過程[14]。在多種高血糖影響的細胞信號通路中，p38 MAPK與高糖刺激的關系非常密切，在高糖環境下p38 MAPK活性顯著增加，激活的p38 MAPK在肝臟糖脂代謝、骨骼肌及脂肪組織糖分攝取、炎性因子產生以及凋亡調控中發揮重要作用，與細胞的凋亡及死亡密切相關[15]，而且，應用p38 MAPK抑制劑顯著改善了糖尿病引起的傷口愈合不良[16]。同時，p38 MAPK為在神經細胞的功能和凋亡調控中發揮重要作用[17]，p38 MAPK通路的抑制對神經細胞具有保護作用[18,19]。因此我們認為，p38 AMPK通路抑制劑在減輕糖尿病相關的神經元損傷中有一定價值。

神經細胞的凋亡在神經系統功能的損害中發揮重要作用[20]。目前已知的凋亡途徑共有3種：線粒體途徑、內質網途徑以及死亡受體途徑，其中線粒體途徑是凋亡調控的主要途徑。線粒體凋亡途徑主要通過BCL家族調節，包括主要對凋亡起抑制作用的BCL-2亞家族(BCL-2)，對凋亡起促進作用的BAX亞家族(BAX)以及BCL-2同源的結構域3亞家族(BAD、BID)，當細胞被某些外界或內在信號影響，凋亡促進蛋白及凋亡抑制蛋白之間的平衡穩態被打破時，凋亡途徑將被激活，出現細胞凋亡[21,22]。研究表明，BCL-2、BAX、BAD、BID作為重要的凋亡調控蛋白，在腦組織中發揮重要作用[23]。

本研究采用不同濃度的高糖處理SH-SY5Y細胞，結果顯示，高糖可顯著促進p38 MAPK的磷酸化，同時增加促凋亡蛋白BAX、BAD、BID的表達，而凋亡抑制蛋白BCL-2的表達則降低，此作用在處理持續3 h時達到頂峰，其中C組p38 MAPK磷酸化程度及各凋亡相關蛋白表達均較為明顯，因此后續p38 MAPK抑制劑相關試驗我們選擇此處理濃度及時間點。加入p38 MAPK抑制劑可顯著減少高糖引起的細胞凋亡及凋亡蛋白的表達。可見高糖濃度的培養基對SH-SY5Y細胞的凋亡有促進作用，該作用可能是通過增加p38MAPK的磷酸化并影響凋亡相關蛋白的表達來實現的。該作用在處理3 h時達高峰。

綜上所述，本研究證實高糖可促進SH-SY5Y細胞凋亡，而p38 MAPK抑制劑可抑制高糖導致的SH-SY5Y細胞凋亡，這為后續糖尿病中樞神經系統保護藥物的研究提供了理論基礎。