p53基因第72密碼子基因多態性與胃潰瘍患者Hp易感性、預后的關系

郝欣，王榮升，李建輝

(承德市中心醫院，河北承德067000)

幽門螺桿菌(Hp)具有高感染性，普通人群Hp感染率約為50%，是消化性潰瘍、遠端胃腺癌和胃淋巴瘤的主要病因[1，2]。研究顯示，Hp可使活性氧過度積累從而導致組織細胞毒性損傷及再生障礙，促使胃部炎癥反應持續存在和加劇；通過促進活性氧和氮的釋放，Hp可使脆性組氨酸三聯體表達下調和白細胞介素8表達上調，以促進胃癌的發生、發展[3]。但是以上具體致病機制尚未完全明確。近年來，與Hp易感性有關的人類基因研究逐漸成為熱點。p53基因是重要的腫瘤抑制基因之一，是目前發現與人類腫瘤相關性較高的基因[4]。p53介導的細胞信號轉導途徑參與調節細胞周期、細胞死亡與凋亡，在調節細胞正常生命活動中起重要作用。但是p53基因突變后會失去對細胞生長、凋亡和DNA修復的調控作用，由抑癌基因轉變為癌基因。p53基因失活突變與多種惡性腫瘤的發生發展密切相關[5]。本研究探討Hp感染胃潰瘍患者p53基因第72密碼子基因多態性，進一步闡明Hp感染胃潰瘍發病的遺傳學機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2015年1月～2015年12月承德市中心醫院消化內科診斷為Hp感染胃潰瘍患者150例(觀察組)，男89例、女61例，年齡(43.72±7.18)歲，病程(3.26±1.82)年；潰瘍部位：胃竇71例、胃角44例、胃體19例、胃底16例。同時選擇非Hp感染的150例胃潰瘍患者作為對照組，男84例、女66例，年齡(45.29±8.25)歲，病程(3.33±2.16)年；潰瘍部位：胃竇59例、胃角52例、胃體21例、胃底18例。兩組年齡、性別、病程、潰瘍部位等比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。胃潰瘍以胃鏡檢查以及X線鋇餐檢查確診。胃鏡檢查時取活檢標本進行快速尿素酶試驗和組織學檢查，若兩種檢查結果均為陽性則判斷為Hp感染陽性，若兩種檢查結果均為陰性則判斷為Hp感染陰性。快速尿素酶試驗和組織學檢查結果不一致的患者不納入研究。

1.2 Hp感染胃潰瘍的治療 Hp感染胃潰瘍患者采用三聯療法聯合胃黏膜保護劑進行治療。三聯療法為埃索美拉唑20 mg+克拉霉素0.5 g+阿莫西林1.0 g，2次/d；胃黏膜保護劑為硫糖鋁片1 g，4次/d。療程為4周。停藥1個月后復查胃鏡，觀察胃潰瘍愈合情況及Hp根除情況。

1.3 p53基因第72密碼子基因型檢測 治療前取EDTA抗凝管分別收集兩組空腹外周靜脈血5 mL，采用北京康為世紀生物技術有限公司的RNApure Blood Kit提取p53基因第72密碼子DNA，以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。采用美國Thermo 公司Nanodrop1000分光光度計檢測DNA的純度和濃度，-80 ℃保存備用。p53基因第72密碼子DVA的PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列：上游5′-AGAGGAATCCCAAAGTTCCA-3′，下游5′-AGAGGAATCCCAAAGTTCCA-3′，其擴增產物大小為413 bp。PCR反應總體系為10 μL：2 × Taq Man Master Mix 5.0 μL，P53基因引物各0.45 μL，Taq Man FAM和HEX 探針各0.25 μL，模板DNA 2.0 μL及去離子水1.6 μL。采用ABI 9700 PCR 儀進行PCR反應，95 ℃預變性5 min，95 ℃變性0.5 min，58 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸0.5 min，進行40 個循環，最后72 ℃延伸6 min。以2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增產物并且以Gene Genius全自動凝膠成像系統(美國Syngene公司)進行分析。PCR產物采用限制性內切酶Bst UI進行酶切，60 ℃水浴過夜。酶切總體系如下：酶切 Buffer 2 μL，p53 PCR產物4 μL，酶0.5 μL，無酶水13.5 μL，共20 μL。酶切產物10 μL經2%瓊脂糖電泳40 min，用Gene Genius全自動凝膠成像系統觀察結果。根據電泳結果酶切產物分為Pro/Pro基因型、Arg/Arg基因型和Pro/Arg基因型。

1.4 統計學方法 采用SPSS15.0統計軟件。計數資料以例數或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗；用Hardy-Weinberg檢驗進行基因型頻率吻合度檢測；用Logistic回歸分析p53基因第72密碼子基因多態性與Hp易感性的關系。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 p53基因第72密碼子基因多態性 p53基因第72密碼子基因PCR擴增產物在413 bp處出現目基因片段的電泳條帶，見圖1。PCR擴增產物經過Bst UI酶切后分別在160、253、413 bp處出現3種電泳條帶，其中在413 bp處出現1條電泳條帶的為Pro/Pro基因型，在253和160 bp處出現2條電泳條帶的為Arg/Arg基因型，而在453、253和160 bp處出現3條電泳條帶的為Pro/Arg基因型。見圖2。

注：M為DNA Ladder；1為陰性對照；2～10為p53基因第72密碼子基因PCR擴增產物。

圖1p53基因第72密碼子基因PCR擴增產物電泳圖

注：M為DNA Ladder；1 為陰性對照；2、3、7為Pro/Pro基因型；5、6、10為Arg/Arg基因型；4、8、9為Pro/Arg基因型。

圖2p53基因第72密碼子基因PCR擴增產物酶切產物電泳圖

2.2 兩組p53基因第72密碼子基因型表達及其與Hp感染的關系 兩組p53基因第72密碼子Pro/Pro、Arg/Arg和Pro/Arg基因型頻率均符合Hardy-Weinber平衡定律(P>0.05)，說明各基因類型在兩種人群中的分布符合遺傳平衡，樣本具有群體代表性。兩組p53基因第72密碼子基因型Pro/Pro、Arg/Arg和Pro/Arg分布頻率比較差異具有統計學意義(P均<0.05)。見表1。多因素Logistic回歸分析結果顯示，與基因型為Arg/Arg和Pro/Arg比較，基因型Pro/Pro的胃潰瘍患者幽門螺旋桿菌感染危險性升高(OR分別為0.586、0.512、1.000，P均<0.05)。

表1 兩組p53基因第72密碼子基因型比較[例(%)]

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.3 Hp感染胃潰瘍患者p53基因第72密碼子基因多態性與臨床預后的關系 藥物治療4周后停藥1個月時，觀察組Hp根除率和潰瘍愈合率分別為77.33%和83.33%。p53基因第72密碼子不同基因型患者Hp根除率和潰瘍愈合率差異具有統計意義(P均<0.05)。見表2。

表2 p53基因第72密碼子不同基因型Hp感染胃潰瘍患者Hp根除和潰瘍愈合情況比較[例(%)]

3 討論

p53基因位于人類17號染色體短臂上，編碼一個相對分子質量為53 kD的核磷酸蛋白，具有轉錄因子的活性，在控制細胞周期、細胞凋亡以及DNA修復過程中發揮重要作用。p53基因是一種抑癌基因，p53介導細胞在DNA損傷后于G1期停滯進行切除和修復，以保持基因組的穩定性，是迄今為止發現的與人類腫瘤最密切相關的基因。目前已發現p53基因多態性至少為10種，多項研究顯示位于第4外顯子的p53基因第72密碼子基因多態性與頭頸腫瘤、肝腫瘤等多種惡性腫瘤的易感性密切相關[6,7]。p53也參與免疫和代謝系統的多種功能，影響干細胞生成[8]。有研究發現，p53組成的信號通路在胃黏膜損傷和修復過程中扮演著極為重要的角色。p53信號分子的異常表達，可造成黏膜細胞損傷，遷移受阻，凋亡加速，進而破壞胃黏膜防御屏障，導致胃黏膜損傷發生。編碼p53基因第72位密碼子的氨基酸包括Arg和Pro，含Arg/Arg和Pro/Pro兩種基因類型的p53均為野生型，Arg/Pro為突變型。野生型和突變型的分子生物學行為和功能相差很大[9]。野生型p53具有負調節細胞生長的能力，可感知細胞基因組的完整性，修復損傷DNA，清除有癌變傾向的細胞，抑制腫瘤細胞增殖，誘導細胞凋亡[10]。在野生型p53中，Arg較Pro有更強的誘導細胞凋亡能力[11]。p53一旦發生突變，則失去抑癌功能，并誘導正常細胞向癌細胞轉化，同時突變型p53阻礙其他野生型p53發揮功能，最終促進腫瘤的發生、演進及轉移[12]。有研究顯示，p53基因第72密碼子多態性可導致乳腺癌患者對化療及內分泌治療反應的不同，影響患者預后及生存[13]。

Hp是一種具有較高感染率的革蘭陰性致病菌，寄生于胃黏膜，目前已知其與慢性胃炎、胃和十二指腸潰瘍、胃黏膜相關淋巴樣組織淋巴瘤和胃癌的發生密切相關[14～18]。由Hp分泌的Cag A蛋白等毒性蛋白可激活核因子κB信號通路，誘導各種炎癥介質生成增加，導致胃黏膜炎癥、胃潰瘍的產生，甚至誘發胃黏膜發生癌變[19]；對胃潰瘍患者Hp易感基因的研究，可為建立胃癌高危人群預警和應用分子標志物早期診斷奠定基礎。本研究顯示，Hp感染陽性胃潰瘍患者p53基因第72密碼子基因型Pro/Pro、Arg/Arg、Pro/Arg與Hp感染陰性胃潰瘍患者比較差異均具有統計學意義；與基因型為Arg/Arg和Pro/Arg的患者比較，基因型為Pro/Pro者Hp感染危險性升高，Hp根除率和胃潰瘍愈合率降低。說明p53基因第72密碼子基因型Pro/Pro可增加胃潰瘍Hp感染的危險并影響患者預后。