食管癌組織中miRNA-375表達及其甲基化與腫瘤發生發展的關系

張雪梅，田浩，魏微微，宋文琦，劉亮，卓越，杜井峰

(1佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江佳木斯154002；2佳木斯市中心醫院；3佳木斯市腫瘤醫院)

食管癌是我國也是世界范圍內常見惡性腫瘤之一，以手術為主的綜合治療是目前主要治療方式，但因其發病隱匿、早期癥狀不明顯，多數患者發現時已到中晚期，錯過了手術最佳時機，5年生存率低于15%[1]，尋找更有價值的生物標記物與治療靶點成為各國學者共同關注的焦點。微小RNA(miRNA)是一類存在于各種真核生物中的小分子非編碼RNA，主要調節內源性基因表達，參與細胞增殖、凋亡、分化等過程[2]。DNA甲基化調控是表觀遺傳學的主要方式，基因啟動子區CpG島的DNA甲基化可決定特定miRNA的表達與沉默[3]。相關研究表明，miRNA-35作為抑癌基因在大腸癌、原發性肝癌中呈異常低表達狀態[4，5]，但目前還少有miRNA-375在食管癌表達及甲基化調控的研究。本研究觀察食管癌組織中miRNA-375表達變化，并探討其表達發生變化的機制及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2016年3月～2017年3月佳木斯大學附屬第一醫院經胃鏡采集的110例新鮮組織標本，根據活檢結果分為食管癌組42例、非癌對照組68例。食管癌患者男30例、女12例；年齡50～72(61.54±7.12)歲；腫瘤高、中分化14例，低分化28例；淋巴結轉移19例；TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期15例，Ⅲ～Ⅳ期27例；病理類型為髓質型20例，潰瘍型13例，覃傘型9例。非癌對照組患者男48例、女20例；年齡55～74(61.32±7.24)歲。兩組性別、年齡比較差異無統計學意義(P均>0.05)。標本采集后迅速置于液氮中冷凍，保存于-80 ℃冰箱。本研究經醫院倫理委員會批準，患者或家屬均知情同意。

1.2 兩組miRNA-375表達檢測 采用實時熒光定量PCR。使用Invitrogen公司TRIzol試劑裂解提取食管癌組織與正常食管組織RNA，采用紫外分光光度計滴定RNA濃度，控制RNA吸光度(OD)260/OD280為1.9～2.1，用無酶水稀釋RNA至500～1 500 ng/μL。用miRcte miRNA Cdna第一鏈合成試劑逆轉錄合成cDNA。采用ABI 7900HT熒光定量PCR儀，熒光染料購自凱基生物SYBR GreenⅠ，試劑盒購自miRcute miRNA。反應體系12.5 μL，擴增條件：熱啟動(95 ℃ 5 min)、變性(95 ℃ 10 s)、退火(56 ℃ 10 s)、延伸(72 ℃ 10 s)，共40個循環。以U6為內參。用2-△△Ct法計算miRNA-375相對表達量。

1.3 miRNA-375啟動子區甲基化檢測 采用甲基化特異性PCR。CpG島預測：采用美國加州大學對克魯茲分校基因數據庫提取miRNA-375序列，通過預測相應基因調控區域，顯示miRNA-375啟動因子存在CpG島(表達可能受DNA甲基化調控)。采用歐洲生物信息學研究所CpG plot軟件預測上述基因調控區域序列，驗證CpG島的存在。用天根生化公司DNA/RNA提取試劑盒提取DNA，檢測含量與純度后，采用亞硫酸氫鈉修飾DNA樣本，使用DNA純化試劑盒進行脫硫處理。采用引物設計程序“MethPrimer”設計合成miRNA-375甲基化、非甲基化特異引物序列，由南京金斯瑞生物科技公司合成。甲基化miRNA-375上游序列：5′-GATTTATAATATTTTGGGGAGGC-3′，下游序列：5′-ATAAACGTAAAAACGAAACTTCGAA-3′；非甲基化miRNA-375上游序列：5′-ATTTAGAATATTTTGGTGGAGGTGA-3′，下游序列：5′-ATAAACATAAAAACAAAACTTCAAA-3′。甲基化陽性判斷：甲基化特異性引物擴增出目的條帶，非甲基化特異性引物有或無條帶擴增出；非甲化：非甲基化特異性引物擴增出目的條帶，甲基化引物未擴增出條帶。

2 結果

2.1 兩組miRNA-37表達比較 食管癌組miRNA-375相對表達量為0.028±0.008、非癌對照組為0.042±0.012。食管癌組miRNA-375相對表達量低于非癌對照組(t=6.692，P<0.05)。

2.2 兩組miRNA-375啟動子區甲基化陽性率比較 食管癌組miRNA-375啟動子區甲基化陽性陽性率為71.43%(30/42)，非癌對照組為23.53%(16/68)。食管癌組miRNA-375啟動子區甲基化陽性率高于非癌對照組(χ2=24.483，P<0.01)。

2.3 miRNA-375表達與食管癌患者臨床病理特征的關系 不同性別、年齡、病理類型食管癌組織miRNA-375相對表達量比較差異無統計學意義(P均>0.05)；低分化、淋巴結轉移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期食管癌組織miRNA-375相對表達量低于高中分化、淋巴結無轉移、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期食管癌組織(P均<0.05)。見表1。

表1 miRNA-375表達與食管癌患者臨床病理特征的關系

2.4 miRNA-375啟動子區甲基化與食管癌患者臨床病理特征的關系 不同性別、年齡、病理類型食管癌組織miRNA-375啟動子區甲基化陽性率比較差異無統計學意義(P均>0.05)；低分化組織學類型、淋巴結有轉移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期食管癌組織miRNA-375啟動子區甲基化陽性率高于高中分化、淋巴結無轉移、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期食管癌組織(P均<0.05)。見表2。

表2 miRNA-375啟動子區甲基化陽性與食管癌臨床病理特征的關系[例(%)]

3 討論

我國是食管癌高發地區，每年食管癌死亡人數高達20萬，約占所有惡性腫瘤死亡人數的16.05%[6]。食管癌發病原因尚不清楚，隨著分子生物學研究的不斷深入，越來越多學者認為食管癌的發生是一個多因素、多基因、多階段共同作用的結果，是致癌基因、抑癌基因結構與功能發生異常不斷累積與協同作用的過程[7]。miRNA、DNA甲基化作為重要表觀遺傳學調控機制，不僅調節機體正常生長發育，也直接參與了腫瘤發生、發展過程[8]。

miRNA是一類小分子單鏈RNA，長度約為18～25個核苷酸，可調節內源性基因表達，參與腫瘤的生成與發展。有研究表明，不同miRNA異常表達或抑制腫瘤細胞增殖、或誘導致癌基因生長。如miRNA-222異常高表達可誘導侵襲性甲狀腺乳頭狀癌的侵襲與轉移[9]。miRNA-375位于人染色體上2q35區上cryba2和Cadc108的基因區域間的片段，是一種胰島特異性miRNA，現已發現在不同腫瘤發病過程，其表達升高或降低各不相同[10]。如在胃癌組織中明顯降低，而在前列腺癌組織中表達明顯升高[11]。對食管癌組織中miRNA-375表達變化的研究較少。本研究食管癌組織中miRNA-375表達低于非癌對照組，且低分化、淋巴結轉移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期食管癌組織miRNA-375相對表達量更低，與陸翰杰等[12，13]文獻報道基本相似。

miRNA表達異常的機制尚末完全闡明，可能與轉錄因子、表觀遺傳修飾等因素有關。DNA甲基化作為表觀遺傳修飾的一種方式，影響著細胞發育與基因表達。DNA甲基化發生于啟動子區CpG島，通過甲基化、去甲基化調節基因的表達或沉默。相關研究表明，人類許多腫瘤中均存在不同程度的DNA異常甲基化現象，啟動子區CpG島出現異常超甲基化可誘導基因轉錄沉默，降低抑癌基因、凋亡基因表達水平，參與腫瘤發生發展。而且啟動區CpG島超甲基化存在于惡性腫瘤癌前病變階段，通過檢測基因甲基化狀態，可作為診斷腫瘤的敏感指標。本研究中，食管癌組織miRNA-375啟動子區甲基化陽性率高于非癌對照組，同樣與腫瘤分化程度、淋巴結轉移、TNM分期相關。

綜上所述，食管癌組織中miRNA-375呈低表達，miRNA-375甲基化可能是導致miRNA-375低表達的主要原因；miRNA-375低表達與組織分化程度、有無淋巴結轉移、TNM分期明顯相關。臨床可將miRNA-375甲基化水平、miRNA-375表達作為食管癌早期診斷及預后判斷的依據。