與多形性膠質母細胞瘤患者生存期相關的權重基因共表達網絡構建

徐曉文 何玉琪 張 露 潘名志 楊旭娜 惠 李 谷曉楚

1.江蘇省蘇州市廣濟醫院臨床檢驗科，江蘇蘇州 215008；2.江蘇省蘇州市廣濟醫院醫務部，江蘇蘇州 215008；3.江蘇省蘇州市廣濟醫院科教部，江蘇蘇州 215008

膠質瘤是一種起源于神經膠質細胞的惡性腫瘤，是中樞神經系統最常見的原發性腫瘤[1]。根據病理評估，WHO將膠質瘤分為低級別和高級別兩類，其中低級別膠質瘤分化良好、多為良性、預后較好；而高級別膠質瘤為未分化、惡性、預后較差，如多形性膠質母細胞瘤中位生存時間約為15個月[1]。癌癥和腫瘤基因圖譜數據庫（The Cancer Genome Atlas，TCGA）是目前全球最大的癌癥基因信息數據庫，提供不同種類癌癥基因突變、表達和甲基化等信息以及患者臨床資料，這為采用系統生物學方法研究腫瘤發生發展、識別決定多形性膠質母細胞瘤患者預后的關鍵因素提供了研究資料[2]。本研究采用權重基因共表達網絡（Weighted Gene Co-Expression Network，WGCNA）分析構建了多形性膠質母細胞瘤權重基因共表達網絡，并與患者生存期進行相關性分析，篩選出與生存期顯著相關的共表達模塊，并進一步利用通路富集分析軟件對模塊中的基因進行通路分析，從而為多形性膠質母細胞瘤臨床治療提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究納入的膠質瘤患者臨床資料和膠質瘤組織RNA測序數據全部從TCGA數據庫獲得。TCGA數據庫共收錄了148例多形性膠質母細胞瘤樣本表達譜數據，其中男95例，女53例；確診年齡（60.0±13.5）歲，平均生存期12.4個月。

1.2 數據預處理

共注釋得到了20 029種RNA表達量。為了減少計算量，排除了在少于20%的個體中表達的基因。通過預處理，保留了16 664個基因轉錄本。采用R軟件平臺的 DESEQ 包對這些RNA測序數據進行均一化處理。

1.3 共表達網絡構建

將均一化后的表達數據以及臨床資料導入R軟件平臺，采用WGCNA軟件包構建多形性膠質母細胞瘤組織的權重基因共表達網絡。

1.4 共表達網絡與臨床資料相關性分析

將獲得的權重基因共表達網絡與患者生存期進行相關性分析，篩選出與生存期強相關的共表達模塊。

1.5 通路分析

將篩選出模塊中的基因導入通路富集分析軟件Consensus Path DB（http://consensuspath-db.org）在線進行通路分析。

2 結果

2.1 共表達網絡構建

基于膠質瘤組織RNA測序數據構建的權重基因共表達網絡共包括31個共表達模塊，處于同一個模塊中的基因具有類似表達模式（見圖1）。

圖1 基于膠質瘤組織RNA測序數據構建的權重基因共表達網絡

2.2 不同共表達模塊與患者生存期相關性

暗寶石綠模塊與多形性膠質母細胞瘤患者生存期顯著相關（r=0.35，P＜0.01）。見圖2。在WGCNA中，特定基因表達量與臨床資料之間的相關性被定義為基因顯著性（Gene significance），而特定基因與模塊特征基因之間表達量上的相關性被定義為模塊身份（Module membership）。在暗寶石綠模塊中，基因顯著性與模塊身份顯著相關（r=0.44，P＜0.01）表明與多形性膠質母細胞瘤患者生存期顯著相關的基因也是該模塊的核心成員。見圖3。

圖2 共表達網絡模塊與多形性膠質母細胞瘤患者臨床資料的相關性分析

圖3 暗寶石綠顏色模塊中199個基因的基因顯著性與模塊身份的相關性分析

2.3 通路分析

199個基因主要富集于整合素、膠原蛋白、硫酸軟骨素等細胞外基質相關通路以及Wnt、表皮生長因子受體（EGFR）、血管內皮生長因子（VEGF）、尿激酶型纖溶酶原激活因子（uPA）和伊立替康等代謝相關通路中。

3 討論

在本研究中，我們基于TCGA數據庫中的多形性膠質母細胞瘤RNA表達譜數據構建了權重基因共表達網絡，并將獲得的31個共表達模塊與多形性膠質母細胞瘤患者生存期進行相關分析，其中一個與生存期強相關的暗寶石綠模塊中的199個基因顯著富集于整合素、膠原蛋白、硫酸軟骨素等細胞外基質相關通路以及Wnt、EGFR、VEGF、uPA和伊立替康代謝等相關通路中。

膠質瘤細胞多數呈現特殊的侵襲浸潤生長方式，是腦膠質瘤顯著的病理學特征[1]。大量研究發現，有很多因子參與了膠質瘤細胞侵襲和浸潤，如VEGF、uPA、整合素、硫酸軟骨素等[3-5]。膠質母細胞瘤能夠自分泌VEGF，促進腫瘤組織血管形成，從而更高效地向正常組織擴散，維持腫瘤組織內部環境穩態[6]。uPA表達于膠質瘤組織邊緣，與膠質瘤侵襲性密切相關，敲除uPA基因的膠質瘤細胞會喪失侵襲性[7]。整合素也是腫瘤侵襲生長的關鍵因素，其通過與細胞外基質成分膠原、硫酸軟骨素等相互作用，以及細胞間黏附和信號傳導，促進腫瘤生長、分化和轉移[8]。

Wnt信號通路是一條高度保守的通路，參與調節包括胚胎器官發育在內的多種過程，包括增殖、分化、凋亡等多種細胞生物學行為[9]。在腦膠質瘤病理過程中，Wnt信號通路與膠質瘤惡性程度相關，并發揮多方面功能：如上調VEGF表達，從而促進腫瘤組織血管生成；促進膠質瘤侵襲生長，敲除Wnt1和Wnt3a能夠抑制膠質瘤細胞增殖和遷移；抑制膠質瘤細胞凋亡，下調beta-catenin水平可以誘導膠質瘤細胞凋亡[10-12]。

EGFR是一種重要的原癌基因，是人表皮生長因子受體家族成員，具有酪氨酸激酶活性，可促進細胞分裂和增殖，參與腫瘤細胞增殖、粘附、新生血管形成、侵襲與轉移，并可抑制腫瘤細胞凋亡[13-14]。在膠質瘤患者中，約50%會出現EGFR擴增、重排、突變和過表達，導致膠質瘤細胞異常增殖，且與膠質瘤分級、惡性程度等呈正相關[15]。針對EGFR的靶向治療可能成為膠質瘤治療的新方向[16]。

伊立替康作為一種拓撲異構酶I抑制劑，具有廣泛抗腫瘤活性，臨床主要用于結直腸癌、小細胞肺癌及卵巢癌等治療[17]。因伊立替康可透過血腦屏障，對中樞神經系統腫瘤具有較強的細胞毒性，因此在腦膠質瘤治療領域具有一定潛力[18]。但伊立替康單藥治療膠質瘤療效不甚理想，且易出現耐藥現象[19]；與替莫唑胺、塞來昔布、舒尼替尼及貝伐單抗等聯用則顯示出較好抗腫瘤活性，提高康復率、延長無進展生存期。

由于樣本收集困難，本研究未采用平行對照來驗證生物信息學分析獲得的結果，這是本研究的不足。但作為探索性研究，我們仍然取得了一些有意義的結果。本研究利用生物信息學工具對組學研究篩選出的基因集進行深入分析，初步確定了與多形性膠質母細胞瘤患者生存期相關的生物學過程及信號通路，并為今后多形性膠質母細胞瘤研究和臨床診治提供了一些思路和啟發。