miRNA及其在肝細胞癌發生發展中作用的研究進展

李彥寧，王建華

(天津中醫藥大學附屬北辰中醫醫院，天津300400)

肝細胞癌(HCC)是原發性肝癌的主要病理類型，發病率居全球惡性腫瘤第五位[1]。HCC具有發病隱匿的生物學特征，故臨床多數患者確診時已屬晚期，臨床治療手段有限甚至無效。臨床亟待新的治療方法來改善HCC的預后。因此深入研究HCC發生發展的分子機制，探索HCC早期診斷的生物學標記物和藥物治療靶點是當前研究的熱點。微小RNA(miRNA)是一類無翻譯蛋白質功能的非編碼RNA分子。近年研究發現，miRNA在HCC組織中呈異常表達，證實其在HCC的發生發展、浸潤和轉移等生物學過程中起重要作用，極有可能為未來早期診斷和治療HCC提供新的理念和方向。miRNA

可影響腫瘤細胞分化、上皮-間質轉化(EMT)、化療敏感性及腫瘤轉移，甚至可能標記HCC干細胞表型。揭示miRNA的作用和機制有助于進一步分析HCC的分子作用機制，為HCC提供潛在基因治療靶點。

1 miRNA概述

miRNA是調節基因表達的一類重要短鏈非編碼RNA，其主要通過調控轉錄后水平參與機體功能調節。miRNA通過其種子序列與mRNA的3'非翻譯區(3'UTR)互補結合以介導mRNA去腺苷酸化或翻譯阻斷[2]。miRNA的基因調控在機體是普遍存在的，人類基因組編碼中有超過1 000個miRNA，并且每個都可以調節多個靶標[3]。提示miRNA對眾多生物過程有一定影響。

miRNA表達譜與HCC的相關性在過去十年中已被廣泛研究。現已明確，人類HCC和非腫瘤性肝臟組織miRNA表達顯著不同。部分miRNA例如miR-21、miR-221和miR-222在HCC組織中呈過表達狀態。這些miRNA通過負調控HCC組織中抑制腫瘤的蛋白質編碼基因來促進腫瘤發生發展[4～6]。以上致癌miRNA也被稱為“oncomiRs”。另一方面，多項研究表明miR-122、miR-125b、miR-139、miR-101和let-7等在HCC組織中的表達周期性下調[7～10]。提示miRNA通過抑制HCC中的致癌基因發揮腫瘤抑制作用。miRNA調控紊亂是早期事件，可在癌前病變肝臟發育不良結節中檢測到，并且可在HCC發生過程中進一步積累[11]。

目前HCC的具體發病機制尚不明確，探究miRNA與HCC發生發展的相關性可為揭示HCC的發病分子機制提供新的方向。根據miRNA在HCC中的生物學功能表現，可以將其分為抑制腫瘤和致腫瘤作用兩類。

1.1 抑制HCC發生發展的miRNA 抗腫瘤miRNA通過多種途徑抑制HCC的發生發展。Wang等[12]在進展期HCC小鼠模型中發現，Myc原癌基因蛋白(MYC)過表達導致miR-122表達下調。另有學者在HCC小鼠模型(敲除MYC)中發現腺相關病毒介導的miR-122過表達能夠抑制腫瘤進展[13]。體外實驗表明，miR-122通過直接靶向調控原癌基因Wnt-1參與Wnt信號通路傳導，進一步破壞HepG2細胞中β-鏈蛋白的穩定性[14]。Hou等[15]研究表明，miR-199a-3p通過抑制p21活化激酶4及RAF-MEK-ERK途徑下游分子表達在HCC中發揮調控作用。提示miRNA可通過調控某些原癌基因發揮抗腫瘤作用。miR-122可通過抑制M2型丙酮酸激酶(PKM2)表達以影響HCC細胞系中葡萄糖的代謝，并且miR-122過表達可降低葡萄糖攝取并逆轉HCC細胞系中的Warburg效應[16]。miR-199a-5p可通過靶向調控己糖激酶2和PKM2來調節HCC中葡萄糖酵解代謝。進一步通過體內和體外研究發現，miR-199a-5p過表達可抑制HCC生長且阻斷缺氧誘導的代謝變化[17,18]。提示miRNA可通過調控腫瘤細胞代謝抑制HCC發生發展。Fornari等研究表明miR-122通過靶向調控細胞周期蛋白G1而影響HCC細胞的細胞周期進程。進一步研究發現，miR-199a-3p在HCC細胞系中通過抑制雷帕霉素和肝細胞生長因子受體信號傳導機制發揮調控作用，并且誘導細胞周期停滯和促進細胞凋亡[19]。NOD/SCID小鼠模型研究發現，miR-122*過表達誘導HepG2細胞中TP53依賴性細胞凋亡并抑制HCC致瘤性[20]。提示miRNA可通過調控腫瘤細胞周期、增殖和凋亡抑制HCC發生發展。

1.2 促進HCC發生發展的miRNA 在HCC組織中表達上調的miRNA亦可通過多種途徑促進HCC發生發展。體外實驗表明，miR-221通過調節腫瘤抑制基因人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(PTEN)和組織金屬蛋白酶抑制因子3促進HCC的發生和HCC細胞的遷移[21]。miR-21通過調節人肝細胞癌中腫瘤抑制基因PTEN的表達，促進HCC的進展[22]。提示miRNA可通過調控腫瘤抑制基因發揮促HCC的作用。miR-221通過組成型激活NF-κB通路促進HCC細胞的生長和侵襲[5]。Gramantieri等[23]研究發現，miR-221負向調控凋亡調節因子家族的促細胞凋亡蛋白BMF表達與肝腫瘤的多灶性轉移相關。研究發現，在二乙基亞硝胺誘導的HCC大鼠模型中miR-221的過表達與索拉非尼耐藥性相關，進一步研究發現miR-221可能通過調節Caspase-3的表達和細胞凋亡發揮作用[24]。提示miRNA可通過影響腫瘤細胞的增殖和凋亡發揮調控HCC的作用。現已明確，miR-221直接靶向調控周期蛋白依賴激酶抑制劑和細胞周期蛋白依賴激酶抑制因子1C促進了人HCC細胞系中細胞周期的進展。提示miRNA可通過調控細胞周期促進HCC發生發展。

2 miRNA對HCC發生發展的調控機制

2.1 miRNA在HBV相關HCC中的調控機制 HBV感染是HCC發生的主要危險因素，在世界范圍內超過50%的HCC病例與HBV感染有關。目前研究已明確HBV直接參與驅動HCC發生的過程。第一，HBV病毒基因組可以整合到人類基因組中，導致基因組不穩定和致癌嵌合轉錄本的產生。第二，HBV蛋白X(HBx)具有高度致癌性，90%的HBx轉基因小鼠可以發生HCC。Wang等[10]研究表明，導入HBx的HepG2細胞中miRNA表達發生了改變，對let-7家族miRNA表達下調的影響尤為顯著。有研究表明HBx可以通過改變宿主中重要的轉錄因子或信號通路來介導miRNA的失調。例如HBx可通過調控TP53和MYC的表達分別抑制miR-148a和miR-16。HBx還可通過激活信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)-IL-6途徑上調致癌基因miR-21的表達[25]。

2.2 miRNA在HCV相關HCC中的調控機制 HCV感染是導致肝硬化和HCC的主要原因之一。HCV誘導HCC發展的分子機制可能與HBV感染具有差異性，其相關HCC組織中的miRNA可以調控免疫應答、細胞周期和代謝途徑等。研究表明HCC發生過程中HCV與宿主miRNA之間存在復雜的相互作用。一方面，HCV感染實質上是改變宿主miRNA的表達以促進其病毒復制。目前研究表明，miR-122對HCV復制至關重要。miR-122通過與其5'UTR結合來穩定HCV RNA。此外，HCV RNA還可以從其內源mRNA靶標中螯合miR-122[26]。故HCV感染在功能上抑制miR-122及其靶標以誘導HCC發生。另一方面，miR-199a直接靶向調控HCV基因組的內部核糖體進入位點。miR-199a-3p過表達以RNA誘導沉默復合體依賴性機制抑制永生化肝細胞中的HCV病毒復制。干擾素β(IFN-β)通過調節宿主miRNA表達部分地發揮其抗病毒作用。IFN-β治療通過下調miR-122表達并使HCV RNA不穩定[27]。同時IFN-β誘導miR-196、miR-296、miR-351、miR-431和miR-448的表達，這些miRNA直接靶向調控HCV RNA并減弱HCV復制[11]。

HCV通過上調宿主miRNA和促使細胞信號傳導途徑失調來促進HCC的形成。miR-155表達由HCV感染誘導，通過激活其上游轉錄因子(NF-κB和P300)，部分上調miR-155表達，從而促進細胞周期進程并抑制細胞凋亡。miR-155還通過靶向調控腺瘤性結腸息肉蛋白而激活Wnt信號傳導調控Wnt靶基因的表達，包括細胞周期蛋白D1、MYC和存活蛋白。BALB/c裸鼠模型中，miR-155過表達促進HCC增殖和皮下腫瘤發展[28]。

2.3 miRNA在上皮-間質轉化和腫瘤轉移中的調控機制 癌癥轉移是癌癥患者病死率高的原因。目前研究表明miRNA參與了HCC轉移。體外和體內研究均證實，miR-124、miR-139和miR-151等發揮抑制癌細胞運動和侵襲的作用[29]。腫瘤抑制miRNA(miR-17和miR-29b)是基質金屬蛋白酶(MMP)的負向調節因子，MMP是癌癥轉移過程中消化細胞外基質蛋白的關鍵酶。miR-200家族，miR-216和miR-181a與人類HCC中轉化生長因子β(TGF-β)介導的EMT有關。研究表明miR-200家族因子通過形成具有E盒鋅指結合蛋白1(ZEB1)和E盒鋅指結合蛋白2(ZEB2)的雙負反饋環路，在HCC中調控EMT。因此，miR-200家族表達下調增強了ZEB1和ZEB2的表達，從而抑制E-鈣黏蛋白的表達以促進EMT[30]。除了調節癌細胞轉移過程之外，miRNA還調節腫瘤微環境中的免疫細胞以促進播散的HCC細胞的定植。TGF-β可下調HCC細胞系中的miR-34a表達，從而增加CCL22產生和招募CD4+CD25+調節性T細胞到腫瘤微環境[11]。Zhou等[31]通過對小鼠異種移植模型研究發現，HCC中miR-28-5p表達下調可以促進IL-34介導的腫瘤相關巨噬細胞(TAM)浸潤。TAM浸潤通過分泌TGF-β進一步抑制miR-28-5p的表達，從而形成調節HCC轉移的前饋環。

2.4 miRNA對HCC干細胞的調控機制 癌癥干細胞(CSC)是具有類似于正常干細胞特征的腫瘤內罕見細胞群。眾多研究表明CSC對癌癥的耐藥性、腫瘤復發和轉移具有重要影響，故CSC成為治療癌癥的潛在靶點，并通過多種方法研究調節CSC功能的分子機制[32]。單細胞克隆HCC干細胞(LCSC)和非LCSC中基因表達的分析研究已經鑒定出導致HCC具有干性表型的miRNA。

CD133被廣泛認為是LCSC表面標記物。CD133+HCC細胞較CD133-HCC細胞在體內具有更高的集落形成能力、擴散能力和致腫瘤能力。差異miRNA表達譜分析表明miR-130b在CD133+LCSCs中呈過表達狀態，并且miR-130增強了HCC細胞系和腫瘤異種移植物的腫瘤干性表型，表現為化學抗性、致腫瘤性和自我更新能力的增強[33]。上皮細胞黏附分子(EPCAM)是另一種常用的LCSC標記物。miRNA表達譜分析研究表明，人HCC樣本中分離的EPCAM+LCSC中富含miR-181、miR-429、miR-150、miR-155和miR-223。這些miRNA通過靶向調控關鍵轉錄調節因子和信號分子來促進HCC細胞干性的表達[34]。

miRNA作為參與調節多種生物和細胞過程的重要調節因子，不同類型的miRNA表達失調與HCC的發生發展密切相關。了解miRNA在人HCC發生發展中作用，對揭示肝癌發生的分子機制有重要價值。