沉默GTPBP4基因對結腸癌細胞生物學行為的影響及機制

唐丹，劉勛，楊志惠

(1西南醫科大學，四川瀘州646000；2西南醫科大學附屬醫院)

結腸癌(CRC)是我國消化系統好發的惡性腫瘤之一，其發病率居腫瘤第3位，致死率居腫瘤第5位[1]。結腸癌的發病率及致死率呈逐年上升趨勢，但發病機制目前仍不清楚。目前結腸癌的治療多采用手術聯合放化療為主，但有部分患者確診時已無手術指征，靶向治療成為治療結腸癌的重要突破點。GTP結合蛋白4(GTPBP4)基因，又名腦紅蛋白基因、核仁G蛋白1基因，定位于人染色體10p15-14[2]。GTPBP4基因在真核生物核糖體60S亞基合成和成熟過程中起關鍵作用[3]，與秀麗隱桿線蟲的生長發育、壽命、脂肪代謝等密切相關，過表達GTPBP4基因將會導致其壽命縮短[4]。GTPBP4與腫瘤的發生發展密切相關。GTPBP4高表達與結直腸癌細胞遷移、侵襲和轉移有關，并且結直腸癌患者高表達GTPBP4預后差[5]。目前有研究發現結腸癌細胞GTPBP4基因敲除后，會引起p53積累，腫瘤細胞增殖受到抑制[6]。p53基因存在兩種形式，野生型p53是公認的腫瘤抑制基因，其過表達或激活將引發腫瘤細胞死亡，低表達或失活則會導致腫瘤發生。抑癌基因p53可以下調凋亡抑制蛋白survivin的表達，而這種負性調節作用能夠誘導細胞凋亡[8]。目前關于GTPBP4基因在結腸癌生物學行為方面的作用及與野生型p53、Survivin相關性的研究相對較少。2017年6月～2018年2月，本研究將GTPBP4-RNAi干擾慢病毒轉染至結腸癌HT29細胞，觀察GTPBP4基因沉默后細胞生物學行為的改變，并探討與p53、Survivin的聯系。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 結腸癌細胞株HT29(上海中科院)；pGCSIL-GFP/GTPBP4-RNAi慢病毒載體(上海吉凱基因科技有限公司)，細胞周期試劑盒(碧云天公司)，細胞凋亡試劑盒(上海凱基)，Transwell小室(Costar公司)，CCK-8試劑(同仁化學研究所)，兔抗人GTPBP4單克隆抗體(Abcam公司)，鼠抗人P53單克隆抗體、兔抗人Survivin單克隆抗體(Cell signaling TEC公司)，鼠抗人GAPDH單克隆抗體(BI公司)；CO2細胞培養箱(Thermo公司)，倒置顯微鏡、熒光顯微鏡(日本Olympus)，PCR擴增儀(Roche480)，紫外分光光度計(艾德)，流式細胞儀(BD公司)。

1.2 HT29細胞慢病毒轉染 胰酶消化對數生長期的HT29細胞，離心收集后，以5×104/mL將細胞懸液接種于6孔板中，于37 ℃、5% CO2的條件培養箱中培養至細胞融合度達30%，隨機分為轉染組與陰性對照組，轉染組加入適量GTPBP4-RNAi慢病毒(感染復數值為10)，陰性對照組轉染含有非特異性干擾序列的陰性病毒。感染48～72 h觀察該細胞熒光的表達情況，當熒光表達率大于80%，收集細胞提取RNA和蛋白，以Real-time PCR和Western blotting證實轉染成功。

1.3 細胞增殖能力檢測 采用CCK8法。取感染72 h后兩組細胞，胰酶消化制成細胞懸液，分別接種到96孔板中，每孔接種體積100 μL，細胞數約1 000個，每組設6個復孔；96孔板放入孵箱內繼續培養24、48、72、96 h后，更換新鮮無血清培養基100 μL，各加入CCK-8 10 μL，放入37 ℃孵箱繼續培養4 h，用酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度。

1.4 細胞遷移能力檢測 采用劃痕實驗。接種細胞前用記號筆在6孔板背后均勻地劃橫線，每孔5條線。將感染后的兩組細胞消化離心后，每孔加入約5×105個細胞。第2天用10 μL槍頭垂直于背后的橫線劃痕。用PBS洗細胞3次，去除劃下的細胞，再加入無血清培養基。放入37 ℃、5% CO2培養箱培養。按0、24、48 h觀察細胞劃痕愈合情況，拍照。

1.5 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell實驗。取轉染后處于對數生長期的細胞，胰酶消化后制成細胞懸液，向準備好的Transwell小室上層中加入1×105個細胞。下室中加入500 μL含10% FBS的完全培養基，每組設立5個復孔，培養24 h。4%多聚甲醛固定小室15 min，倒轉放置，風干。0.1%結晶紫染色20 min，PBS洗3次。顯微鏡下觀察，隨機計數10個高倍視野穿過基質膠的細胞數，取平均值。

1.6 細胞周期檢測 采用流式細胞術。取處于對數生長期的兩組細胞，胰酶消化后，以2 000 r/min離心5 min收集細胞沉淀，PBS洗滌離心3次后，進行PI染色，室溫避光孵育，流式細胞儀上機檢測。

1.7 細胞凋亡檢測 采用AnnexinⅤ-APC單染法。取處于對數生長期的兩組細胞，胰酶消化后，PBS洗滌離心，收集細胞沉淀；1×binding buffer液洗滌細胞沉淀1次，以2 000 r/min離心5 min，收集細胞；細胞沉淀加入1 mL 1×staining buffer重懸；取細胞懸液100 μL(1×105～1×106個細胞)，加入AnnexinV-APC 5 μL進行染色，室溫避光孵育15 min后，轉移至流式細胞儀進行檢測，每組重復3次。

1.8 細胞克隆形成實驗 胰酶消化法收集對數生長期的兩組細胞，制成細胞懸液，重懸后進行細胞計數。6孔板每孔接種1×104個細胞，每個轉染組設3個復孔。于CO2恒溫孵箱中繼續培養細胞，培養期間每3天觀察一次細胞生長狀態并且換液，細胞連續培養2周后終止；用PBS洗滌后每孔加入1 mL多聚甲醛液，固定30～60 min后，PBS 洗滌。再每孔加入無雜質結晶紫染液500 μL，染色20 min，ddH2O洗滌多余染料后，計數，拍照。

1.9 細胞內p53、Survivin蛋白表達檢測 采用Western blotting。RIPA裂解法提取細胞總蛋白，采用BCA法對蛋白進行定量，加入PBS和Loading Buffer 補齊，99 ℃變性10 min。 配置10%的分離膠和5%的濃縮膠，經恒壓60 V電泳0.5 h后轉為恒壓120 V繼續電泳1.5 h，電轉100 V 2 h至PVDF膜，5%的脫脂奶粉(或BSA)封閉2 h，根據相關蛋白的分子量切膠后，分別加入p53、Survivin抗體(1∶1 000)及GAPDH抗體(1∶2 000)，4 ℃搖床孵育過夜。1×TBST洗膜4次，每次5 min，加入二抗后室溫下搖床孵育1 h，再次1×TBST洗膜4次，并運用ECL法檢測。Image J軟件分析各條帶灰度值。蛋白相對表達量=目的基因灰度值/內參灰度值。

1.10 細胞內p53、Survivin蛋白定位檢測 采用細胞免疫熒光法。取感染后處于對數生長期的兩組細胞，胰酶消化離心，按每孔5×105個細胞接種于裝有蓋玻片的6孔板中，待細胞貼壁后加入30 mg/L DADS。繼續培養24 h。取出蓋玻片，PBS洗滌，用多聚甲醛固定30 min。0.5% Triton X-100通透細胞20 min，PBS洗滌3次。山羊血清封閉30 min。加入一抗，4 ℃孵育過夜。PBS清洗后，加入二抗，室溫濕盒內避光孵育2 h。PBS洗滌。DAPI避光下復染細胞核10 min。最后封片，顯微鏡檢測熒光表達情況。

2 結果

2.1 沉默GTPBP4基因對HT29細胞增殖能力的影響 培養24、48、72、96 h轉染組OD值分別為0.77±0.01、1.06±0.02、1.64±0.02、2.10±0.06，陰性對照組分別為0.92±0.03、1.34±0.04、2.27±0.02、3.17±0.09。各時間點轉染組細胞增殖能力較陰性對照組低(P均<0.05)。

2.2 沉默GTPBP4基因對HT29細胞遷移能力的影響 劃痕后48 h，轉染組相對遷移距離(500.01±1.82)較陰性對照組(781.23±10.51)短(P<0.05)。

2.3 沉默GTPBP4基因對HT29細胞侵襲能力的影響 接種48 h后，轉染組穿膜細胞數(91±4)個/5HPF，陰性對照組為(263±12)個/5HPF，轉染組穿膜細胞數較陰性對照組少(P<0.05)。

2.4 沉默GTPBP4基因對HT29細胞周期的影響 轉染組G1期細胞比例(82.16%)較陰性對照組(62.56%)高，G2期細胞細胞比例(5.91%)較陰性對照組(6.17%)低，S期細胞比例(11.93%)較陰性對照組(31.27%)低。兩組各周期細胞分布比例比較差異有統計學意義(P均<0.05)。

2.5 沉默GTPBP4基因對HT29細胞凋亡的影響 轉染組細胞凋亡率(30.09%)較陰性對照組細胞(9.41%)高(P<0.05)。

2.6 沉默GTPBP4基因對細胞克隆形成的影響 轉染組克隆形成的細胞集落數目為(68±2)個/孔，陰性對照組為(115±3)個/孔，轉染組克隆形成的細胞集落數目較陰性對照組少(P<0.05)。

2.7 沉默GTPBP4基因對細胞內p53及Survivin蛋白表達的影響 轉染組p53及Survivin蛋白相對表達量分別為1.339 8±0.013 6、0.453 3±0.027 5，陰性對照組分別為0.747 1±0.100 9、0.856 8±0.079 0。與陰性對照組比較，轉染組p53蛋白相對表達量高(P<0.05)，Survivin蛋白相對表達量低(P<0.05)。

2.8 兩組蛋白定位情況 兩組p53、Survivin蛋白均主要表達于細胞核，未發生表達位置改變。

3 討論

GTPBP4編碼的GTP結合蛋白4，是由633個氨基酸組成的重要功能蛋白[8]，定位于細胞核。GTPBP4在腫瘤發生發展過程中扮演重要角色。GTPBP4在神經鞘瘤中結合merlin，通過抑制cyclinD1表達，最終抑制腫瘤細胞增殖[9]。與以上研究結果相反，Lunardi[6]等發現GTPBP4的表達與野生型p53乳腺癌患者生存率呈負相關。GTPBP4高表達與結直腸[5]、肝癌[10]細胞遷移、侵襲和轉移有關，并且GTPBP4高表達患者預后差。本研究發現，在有效敲減GTPBP4基因后，結腸癌細胞的周期阻滯、克隆形成明顯減少，細胞凋亡率升高，細胞侵襲能力減弱。提示GTPBP4可能是癌基因。

p53是一種腫瘤抑制因子，常在人類腫瘤中發生突變[11]，突變后的p53由癌基因轉變為抑癌基因，具有促進腫瘤細胞增殖、生長，而抑制腫瘤細胞凋亡的作用，可以抵消野生型p53的正常功能[12,13]。本研究沉默GTPBP4基因后，HT29細胞內p53蛋白表達升高，細胞一系列的生物學行為受到抑制。同時有研究指出藥物刺激等外界因素作用，能使HT29細胞的突變型p53恢復為野生型p53[14]。據此推測，沉默GTPBP4基因后，細胞內表達的p53蛋白可能主要以野生型為主。在后續實驗中可通過檢測野生型p53下游靶基因P21、Hdm2等的表達加以驗證。研究顯示GTPBP4是p53的陰性調控子，能直接結合p53，導致其腫瘤抑制作用減弱[6]。沉默GTPBP4后，腫瘤細胞的增殖能力降低，而凋亡增加，p53蛋白表達上調，Survivin蛋白表達降低。可能由于GTPBP4對p53的抑制作用減弱，引起p53表達上調。另外，由于GTPBP4是核糖體60S晚期生物合成和成熟的關鍵因素，則GTPBP4可能通過核糖體-Mdm2-p53信號軸增強p53的核內表達，進而影響細胞增殖和凋亡。當各種原因導致核糖體RNA合成減少，核仁處于應激狀態時，核糖體-Mdm2-p53通路被觸發，即核糖體與MDM2相互作用激活p53。在應激條件下，磷酸化的p53從MDM2-p53復合物中解離，而MDM2是p53的負性調節蛋白以及E3泛素化連接酶，磷酸化的p53進一步抑制MDM2-P53的結合，MDM2介導的p53泛素化降解反應受到抑制后，p53表達上調[15]。細胞表達野生型p53或p21(Cip1)使細胞周期阻滯在G1期。也有研究表明野生型p53能抑制Survivin的mRNA及蛋白表達水平，對survivin有負性調節作用，其機制是p53對Survivin啟動子中染色質的修飾，致使其沉默[16]。Survivin屬于凋亡抑制蛋白家族成員之一，能促進腫瘤細胞增殖、血管生成，并具有抗凋亡等生物學功能[17]。已經證明下調Survivin在動物體內的表達，能夠抑制腫瘤生長。本研究發現，沉默GTPBP4基因，p53蛋白表達量增加，而Survivin蛋白表達量降低，并且二者表達定位仍然在細胞核內。表明GTPBP4基因在結直腸癌細胞核可能與p53、Survivin存在相互作用，共同參與結直腸癌的發生發展。

綜上所述，GTPBP4基因沉默后，可能對p53抑制作用減弱和影響核糖體蛋白的生物合成觸發了RP-Mdm2-p53這一信號通路，使抑癌基因p53被激活，抑制抗凋亡蛋白Survivin表達，最終發揮抑制結腸癌細胞增殖誘導其凋亡的作用。當然這一結論還需結合體內實驗來進一步驗證。GTPBP4的表達與結腸癌細胞的增殖、凋亡、侵襲、轉移能力密切相關，值得關注的是其與結腸癌患者預后也有一定的相關性。因此，對GTPBP4的研究為今后腫瘤的靶向治療及預后評估奠定基礎。