HIF-3α對肝細胞癌多藥耐藥的影響及其機制

占靜，何曉曉，邱夢君，孫飛，魏柏

(華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院，武漢430077)

肝細胞癌是原發性肝癌最常見的組織學類型，是世界上第五大常見惡性腫瘤，在惡性腫瘤相關死亡原因中居第三位[1]。肝細胞癌起病隱匿，多數患者就診時已進展至中晚期，錯過了最佳手術時機[2]。因此，多學科綜合治療成為目前國內外肝細胞癌治療的主要模式。化療在肝細胞癌綜合治療中占有重要地位。但肝細胞癌多藥耐藥導致常規化療效果并不理想[3]。腫瘤化療多藥耐藥產生的原因十分復雜，與多藥耐藥基因1(MDR1)、多藥耐藥相關蛋白2(MRP2)、肺耐藥蛋白(LRP)、谷胱甘肽硫轉移酶pi(GST-pi)、拓撲異構酶Ⅱα(TopoⅡα)等有關[4]。缺氧是實體瘤中普遍存在的現象，而腫瘤細胞在缺氧狀態下對化療藥物不敏感。因此，缺氧可能是導致腫瘤化療多藥耐藥的重要原因[4,5]。缺氧誘導因子(HIF)是一類介導細胞適應低氧狀態所必需的轉錄激活因子，由α、β亞基組成。在多種腫瘤中，HIF表達增加能激活許多靶基因轉錄，從而引起細胞代謝重編程、細胞增殖和凋亡以及耐藥性改變等。目前發現的HIF α亞基有3種異構體，分別為HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α[6]。研究證實，HIF-1α、HIF-2α可促進腫瘤化療多藥耐藥產生[7～9]。而HIF-3α與腫瘤化療多藥耐藥的關系目前尚不清楚。2017年9月～2018年6月，本研究觀察了HIF-3α對肝細胞癌多藥耐藥的影響，并探討其可能的作用機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細胞株HepG2(以下稱HepG2細胞)，購自中國典型培養物保藏中心。HIF-3ɑ基因靶序列及其相關引物序列，由武漢谷歌生物科技有限公司設計合成。2720熱循環PCR儀，美國Applied Biosystems公司；凝膠圖像分析系統，上海天能科技有限公司；熒光顯微鏡，日本奧林巴斯公司。感受態大腸桿菌DH5α、免疫組化SP試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒，武漢谷歌生物科技有限公司。TRIzol、Power SYBR?Green PCR Master Mix，美國Life Technologies公司；PrimeScriptTMRT Reagent Kit，上海捷瑞生物工程有限公司；質粒DNA抽提試劑盒，北京天根生化科技有限公司；包裝質粒載體GV287(Ubi-MCS-3FLAG-SV40-gcGFP)及輔助包裝質粒pHelper1.0、pHelp-er2.0，上海吉凱基因化學技術有限公司。HIF-3α抗體，英國Abcam公司；MDR1、β-actin抗體，美國Santa Cruz Biotechnology公司；MRP2、LRP、GST-pi、TopoⅡα抗體，美國Proteintech Group公司。

1.2 HIF-3α過表達慢病毒構建 參照GeneBank中HIF-3α(NM_152795.2)基因編碼序列，設計合成HIF-3α基因片段。在BamHI/AgeI酶切位點對GV287載體進行雙酶切，然后進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳分離純化。分離純化產物與GV287載體酶切后產物用T4 DNA連接酶連接。將連接產物轉染至感受態大腸桿菌DH5α，使用嘌呤霉素篩選培養。挑選陽性克隆進行酶切和測序，并與目的基因序列進行比對。

1.3 慢病毒包裝與滴度測定 ①慢病毒包裝：將上述構建的重組GV287-HIF-3α慢病毒質粒與輔助包裝質粒pHelper1.0、pHelper2.0，按5∶3∶2共轉染293T細胞，轉染6 h更換培養液，繼續轉染48 h。收集培養液上清液，經0.45 μm濾器過濾，4 ℃、25 000 r/min離心2 h，用DMEM培養基重懸細胞沉淀，充分溶解后10 000 r/min離心5 min，留取上清，-80 ℃保存。②慢病毒滴度測定：取對數生長期、生長狀態良好的293T細胞，接種于96孔板，每孔4×104個；根據慢病毒預期滴度，準備7～10個無菌EP管，每管加入90 μL無血清培養基；取待測慢病毒原液10 μL加入第1個EP管中，充分混勻，取10 μL再加入第2個EP管中，依此類推，直至最后1個EP管。將稀釋好的病毒溶液加入96孔板，繼續培養72 h，觀察熒光標記的慢病毒表達情況，統計綠色熒光蛋白標記細胞數目，計算慢病毒滴度。慢病毒滴度=綠色熒光蛋白標記細胞數目/慢病毒原液量。

1.4 HIF-3α過表達對HepG2細胞多藥耐藥相關基因表達的影響

1.4.1 HIF-3α過表達的HepG2細胞構建 ①細胞傳代培養：將HepG2細胞接種于含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱中培養；當細胞融合70%～80%時，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶4傳代。②細胞轉染：取傳2代、對數生長期、生長狀態良好的HepG2細胞，接種于6孔板，每孔1×105個。隨機將細胞分為HIF-3α組、陰性對照組、空白對照組，每組設2個復孔。HIF-3α組按10 MOI加入HIF-3α過表達慢病毒和含聚凝胺的培養基，陰性對照組按10 MOI加入GV287空載體和含聚凝胺的培養基，空白對照組僅加入等量培養基。轉染12 h，吸棄含聚凝胺的上清液，加入新鮮含5%嘌呤霉素的培養基繼續培養60 h。③轉染效率驗證：采用real-time PCR法。收集各組細胞，TRIzol法提取細胞總RNA，按PrimeScriptTMRT Reagent Kit說明將總RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，按Power SYBR?Green PCR Master Mix說明進行PCR擴增。引物序列：HIF-3α上游引物5′-GGGAGAACCACTGGATGCCT-3′，下游引物5′-AGAAACTAAAGTAGGTGGGGA-3′；β-actin上游引物5′-AGTTGCGTTACACCCTTTCTTGAC-3′，下游引物5′-GCTCGCTCCAACCGACTGC-3′。按試劑盒說明配制反應體系。反應條件：95 ℃ 30 s， 95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s共40個循環。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.4.2 HIF-3α過表達對HepG2細胞MDR1、MRP2、LRP、GST-pi、TopoⅡα mRNA表達的影響 采用real-time PCR法。收集各組細胞，采用TRIzol法提取細胞總RNA，按PrimeScriptTMRT Reagent Kit說明將總RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，按Power SYBR?Green PCR Master Mix說明進行PCR擴增。引物序列：MDR1上游引物5′-ATATCAGCAGCCCACATCAT-3′，下游引物5′-GAAGCACTGGGATGTCCGGT-3′；MRP2上游引物5′-ACGGACAGCTATCATGGCTTCT-3′，下游引物5′-TGGTCACACCATGAGCTTCT-3′；LRP上游引物5′-GTCTTCGGGCCTGAGCTGGTGTCG-3′，下游引物5′-CTTGGCCGTCTCTTGGGGGTCCTT-3′；GST-pi上游引物5′-ACCCCAGGGCTCTATGGGAA-3′，下游引物5′-TGAGGGCACAAGAAGCCCCT-3′；TopoⅡα上游引物5′-TGACAGTGAAGAAGACAGC-3′，下游引物5′-GAGAGACACCAGAATTCAA-3′；β-actin上游引物5′-AGTTGCGTTACACCCTTTCTTGAC-3′，下游引物5′-GCTCGCTCCAACCGACTGC-3′。按試劑盒說明配制反應體系。反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s共40個循環。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.5 統計學方法 采用SPSS18.0統計軟件。計量資料以平均數表示，結果比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HIF-3α過表達慢病毒構建結果 人HIF-3α全長53 386 bp，瓊脂糖凝膠電泳顯示片段大小如預期。挑取陽性克隆測序，結果與GenBank中HIF-3α序列完全一致。

2.2 慢病毒包裝及其滴度 培養72 h，熒光顯微鏡下可觀察到大量綠色熒光，證明慢病毒包裝成功。經計算，慢病毒滴度為1.0×108TU/mL。

2.3 各組HIF-3α表達比較 空白對照組、陰性對照組、HIF-3α組HIF-3α mRNA相對表達量分別為1、1.08、2 100。HIF-3α組HIF-3α mRNA相對表達量明顯高于陰性對照組和空白對照組(P均<0.05)，而陰性對照組與空白對照組比較P>0.05。

2.4 各組MDR1、MRP2、LRP、GST-pi、TopoⅡα mRNA表達比較 空白對照組、陰性對照組、HIF-3α組MDR1 mRNA相對表達量分別為1.00、1.08、0.97，MRP2 mRNA相對表達量分別為1.00、1.08、1.00，LRP mRNA相對表達量分別為1.00、1.08、1.61，GST-pi mRNA相對表達量分別為1.00、1.08、1.20，TopoⅡα mRNA相對表達量分別為1.00、1.08、0.87。與空白對照組和陰性對照組比較，HIF-3α組GST-pi、LRP mRNA相對表達量均明顯升高(P均<0.05)，其余多藥耐藥基因相對表達量組間兩兩比較P均>0.05。

3 討論

原發性肝癌是嚴重威脅人類健康的重大疾病之一，具有流行性廣、病程短、病死率高等特點[10，11]。目前，原發性肝癌的治療方法有外科手術、放療、化療等。由于多數患者就診時已屬中晚期，錯過了根治性手術最佳時機，藥物治療成為其主要治療手段。但藥物治療，即使是新型的靶向藥物，仍然無法避免治療數月后出現的耐藥問題，特別多藥耐藥，已成為影響腫瘤藥物治療效果的最大障礙[4]。腫瘤多藥耐藥的機制尚不完全清楚，已知涉及多藥耐藥的基因主要包括：①以細胞膜上能量依賴式外排泵介導的MDR，如MDR1、MRP；②以細胞質中酶介導的MDR，如GSTs；③以細胞核核孔蛋白介導的MDR，如LRP；④以細胞核內酶介導的MDR，如TopoⅡ[4]。這些MDR參與腫瘤多藥耐藥過程，是目前監測腫瘤多藥耐藥的重要標志物。

缺氧是實質性腫瘤微環境的基本特征之一。缺氧環境不僅能促進腫瘤細胞增殖、遷移和血管生成，還能抑制腫瘤細胞分化、凋亡。近年研究發現，缺氧環境與腫瘤的多藥耐藥密切相關[12]。HIF是一種可上調包括血管內皮生長因子、基質金屬蛋白酶、糖酵解酶等靶基因表達的核轉錄因子，是缺氧應答反應時最重要的調節因子之一[12]。HIF可能是實體瘤發生、發展及多藥耐藥的關鍵因子之一。HIF包括HIF-α和HIF-β。HIF-3α作為HIF-α家族的一員，其結構與HIF-1α、HIF-2α具有高度相似性。有研究指出，HIF-3α與HIF-1α、HIF-2α具有協同作用。Tanaka等[13]研究發現，HIF-1α和HIF-3α在細胞中定位一致，在siRNA介導的人腎細胞癌中，敲低HIF-1α亦能明顯下調HIF-3α。Pasanen等[14]研究證實，HIF-3α在缺氧期間可誘導HIF-1α表達。Hatanaka等[15]研究發現，HIF-3α的啟動子活性能被HIF-2α特異性激活。HIF-2α能特異性結合mHIF-3α啟動子中-251和-228之間的序列，這對HIF-2α的激活是必需的。在人臍靜脈內皮細胞中，HIF-3α表達由HIF-1α和HIF-2α共驅動[16]。Warfel等[17]研究發現，敲低腫瘤細胞HIF-1α表達能明顯降低缺氧誘導的MDR1表達。朱虹等[18]研究發現，隨著缺氧時間延長，HepG2細胞中多藥耐藥相關基因MDR1、MRP1、LRP表達逐漸升高，而且這些多藥耐藥相關基因表達升高與HIF-1α表達呈同步化改變。Yuan等[19]研究顯示，HIF-2α亦可誘導肝癌5-氟尿嘧啶耐藥細胞中多藥耐藥基因表達。有研究還發現，HIF-2α能通過干性通路引起肝癌MDR[20]。以上研究表明，HIF-1α、HIF-2α均為促進腫瘤多藥耐藥的關鍵分子。而HIF-3α的結構與HIF-1α、HIF-2α具有高度相似性，因此推測HIF-3α也可能是腫瘤多藥耐藥的關鍵分子。

本研究成功構建了HIF-3α過表達慢病毒，其測序結果與GeneBank中HIF-3α的基因編碼序列完全一致。該基因編碼序列慢病毒包裝后，熒光顯微鏡下可見大量綠色熒光，說明慢病毒包裝成功，經計算，慢病毒滴度為1.0×108TU/mL。用HIF-3α慢病毒轉染HepG2細胞，結果發現，HIF-3α組HIF-3α mRNA相對表達量明顯高于陰性對照組和空白對照組，而陰性對照組與空白對照組比較差異無統計學意義，證實該慢病毒成功轉染入HepG2細胞。進一步研究發現，HIF-3α組GST-pi、LRP mRNA相對表達量均明顯高于空白對照組和陰性對照組，而MDR1、MRP2、TopoⅡα mRNA相對表達量組間兩兩比較差異均無統計學意義。結果表明，HIF-3α通過激活藥物穿胞過程中LRP及細胞解毒過程中GST-pi的表達，促進肝細胞癌多藥耐藥發生。

綜上所述，HIF-3α可能與肝細胞癌多藥耐藥有關，其機制與上調多藥耐藥相關基因GST-pi、LRP表達有關。