細胞應激對外泌體功能影響的研究進展

劉朝陽，李文博，王煒，胡雅茹，任偉宏

(1河南中醫藥大學，鄭州 450000；2河南中醫藥大學第一附屬醫院)

外泌體是細胞內多囊泡體與細胞膜融合釋放到細胞外環境的直徑30～150 nm的囊泡，外泌體由脂質、核酸(mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA)和蛋白質(受體，轉錄因子，酶)組成[1,2]。細胞通過外泌體將脂質、核酸或蛋白質轉移至受體細胞中，介導細胞間通信，調節細胞的生理和病理狀態，如炎癥、免疫反應、血管生成、細胞死亡、神經退行性疾病和癌癥等[3]。細胞應激是指在細胞受到各種理化代謝或生物性損傷因素時，產生一系列適應性的代償反應，以增強細胞的抗損傷能力和生存能力。現已發現，細胞能夠通過外泌體來對應激做出反應，即不同的應激因素會影響細胞分泌的外泌體的豐度、組成以及功能，以此來調節細胞間的信息交流[4]。對外泌體介導的細胞應激反應的深入研究，有助于人們闡明疾病的發病機制以及疾病治療的療效。現就細胞應激(包括熱應激、氧化應激、低氧應激、基因毒應激、營養應激)對外泌體功能的影響進行綜述。

1 熱應激對外泌體功能的影響

熱是最常見的應激因素之一，蛋白質會因溫度升高而變性，進而失去活性和喪失功能，因此熱應激是細胞應激中典型的蛋白毒性類型。蛋白質功能發生變化會干擾細胞內部的穩態，產生熱休克反應(HSR)。HSR的主要效應物是熱休克蛋白(HSP)，HSP能幫助蛋白質恢復正常的生理功能，維持細胞的穩態。研究表明，不論外泌體來源如何，其內部均廣泛存在著HSP70和HSP90[5]。Cho等[6]發現熱應激(43 ℃，30 min)處理后的小鼠結腸癌細胞分泌的外泌體中HSP70的含量較未經處理的細胞高，同時，熱應激處理后產生的外泌體能夠激活樹突狀細胞和巨噬細胞，觸發協同免疫反應，并能增強輔助性T細胞1(Th1)型免疫應答，清除腫瘤細胞。Zhong等[7]發現，熱應激(42.8 ℃，4 h)能夠使胃癌患者的惡性腹水中外泌體的HSP70和HSP60含量升高，這些外泌體可以促進樹突狀細胞的成熟并提高細胞毒性T淋巴細胞的抗腫瘤活性。熱應激后的細胞釋放的外泌體能夠介導無應激細胞的旁觀者效應，與正常細胞釋放的外泌體相比，45 ℃處理1 h后的細胞釋放的外泌體能夠降低受體細胞的活性，并增加受體細胞中DNA損傷和細胞凋亡的水平，另一方面，熱應激后生成的外泌體也可以增強受體細胞的抗熱激能力，顯示出熱應激生成的外泌體的雙面作用[8]。Guo等[9]發現，在熱應激的巨噬細胞生成的外泌體中含有大量的HSP70，通過HSP70誘導的IL-6將調節性T細胞轉化為Th17細胞，產生抗腫瘤的作用。也有人研究了細胞在熱應激作用下產生的外泌體中的RNA變化。Chen等[10]發現熱應激的血管內皮細胞產生的外泌體中存在著多種上調的miRNA，這些上調的miRNA的靶向基因主要是細胞凋亡相關的基因，外泌體中還有10個上調和10個下調的lncRNA，但它們的功能尚未研究清楚，不過外泌體中的這些RNA的變化可以作為中暑診斷的非入侵性生物標志物。

2 氧化應激對外泌體功能的影響

氧化應激是指機體內活性氧(ROS)的異常增多，抗氧化劑無法清除過多的ROS，ROS與抗氧化劑防御系統失衡，導致細胞的正常生理功能受到不同程度的影響。ROS對細胞的影響取決于ROS的濃度和種類，例如，低濃度的ROS可刺激細胞增殖，而高濃度的ROS會導致細胞周期停滯甚至凋亡或死亡。研究發現，外泌體似乎可以幫助人們更好的解釋ROS對細胞的作用機制。Saeed-Zidane等[11]將牛顆粒細胞與H2O2共孵育生成的外泌體與正常細胞生成的外泌體中的mRNA對比后發現，核因子E2相關因子2(Nrf2)、過氧化氫酶(CAT)和硫氧還蛋白1(TXN1)的mRNA在共孵育后的外泌體中含量更高，細胞攝取這種外泌體后，Nrf2及其選擇性下游抗氧化劑(CAT和TXN1)的mRNA水平顯著增加，并且Nrf2和CAT1基因的蛋白質表達也顯著增加，這些物質增強了細胞的抗氧化能力，使細胞免受不利環境產生的氧化應激的損傷。Sheller等[12]通過蛋白質譜分析發現，人羊膜上皮細胞在香煙煙霧提取物誘導的氧化應激的作用下產生的外泌體比正常細胞的外泌體含有48種獨有的蛋白質，與細胞外調節蛋白激酶/絲裂原活化蛋白激酶(ERK/MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)、上皮黏附連接信號傳導途徑和嗜酸性炎癥相關的蛋白質含量偏高，通過蛋白質免疫印跡分析還發現，來自應激細胞的外泌體中也含有較高含量的p38 MAPK，這表明外泌體可以反映親代細胞的生理狀態，并且可以用于監測妊娠情況。Biasutto等[13]發現，在氧化應激作用下的人視網膜上皮細胞分泌的外泌體與正常細胞分泌的外泌體相比，外泌體所含的蛋白質的含量和種類發生了變化，氧化應激產生的外泌體中的蛋白質與細胞死亡、細胞增殖以及新陳代謝有關，外泌體中蛋白質的變化說明外泌體在視網膜氧化應激相關疾病中具有潛在的診斷價值。

3 低氧應激對外泌體功能的影響

氧對維持機體生命活動十分重要，在細胞處于低氧狀態時，細胞將通過激活雷帕霉素靶蛋白(mTOR)激酶和低氧誘導因子(HIF)相關的途徑，停止細胞周期以減少能量消耗。現已發現，外泌體可能是細胞在低氧條件下的細胞間通信的主要參與者，而且對缺氧的反應遠遠高于細胞水平。Kore等[14]發現，低氧(0.5% O2)條件培養的膠質母細胞瘤分泌的外泌體中關于血管生成和細胞外基質重塑的蛋白質含量顯著增加，如蛋白賴氨酸-6-氧化酶(LOX)、血小板反應蛋白-1(TSP1)、血管內皮因子(VEGF)等，同時，低氧時細胞分泌的外泌體能夠誘導血管生成和增強細胞的活力。Cosme等[15]分析了小鼠心臟成纖維細胞在正常(21% O2)和低氧(2% O2)兩種條件下釋放的外泌體的蛋白質組，分別鑒定出1 752和1 616種蛋白質，定量分析顯示在缺氧條件下釋放的外泌體中有144種蛋白質的表達存在顯著差異(71種蛋白質顯示上調，另73種蛋白質顯示下調)，而且在缺氧條件下釋放的外泌體中富含的蛋白質主要與線粒體有關，表明外泌體具有維持因缺氧而受損的線粒體功能的作用。Ramteke等[16]研究發現，前列腺癌細胞在低氧(1% O2)時產生的外泌體與正常時產生的外泌體相比直徑變小，且含有的蛋白質種類更多，同時低氧時產生的外泌體顯示出更高的金屬蛋白酶活性，并能誘導微環境的變化，增強前列腺癌細胞的侵襲性。Yu等[17]研究了低氧應激對肝癌細胞外泌體中RNA的影響，發現低氧不僅會使外泌體的產量增加，而且外泌體中miRNA-1273f的含量也較高，外泌體在低氧時通過轉運miRNA-1273f來增強腫瘤細胞的增殖、遷移和轉移的能力。Qian等[18]同樣分析了低氧應激對細胞外泌體中RNA的影響，在低氧應激的膠質瘤細胞釋放的外泌體所含的RNA中,miRNA-1246的含量最高，miRNA-1246能夠激活信號轉導及轉錄激活因子(STAT)信號通路并抑制核因子激活的B細胞的κ-輕鏈增強(NF-κB)信號通路，誘導M2巨噬細胞的極化。

4 基因毒應激對外泌體功能的影響

細胞內遺傳物質的穩定與細胞穩態的維持密切相關，在電離輻射(IR)或紫外線輻射、烷化劑、ROS以及拓撲異構酶和解螺旋酶的抑制劑等的作用下，DNA會產生不同程度的損傷，而細胞可通過復雜的分子機制來修復DNA以維持基因組的穩定，DNA損傷后的調控包括細胞周期檢查點、DNA修復以及是否在DNA無法修復時激活細胞程序性死亡[19]。研究發現，基因毒應激會影響細胞外泌體的釋放及組成。Jelonek等[20]分析了人咽鱗癌細胞在IR作用下分泌的外泌體中的蛋白質組分，發現IR后的細胞分泌的外泌體存在236種特異性蛋白質，且外泌體中含有過量表達的參與細胞轉錄和翻譯、細胞分裂和細胞信號轉導相關的蛋白質。Abramowicz等[21]用IR處理頭頸部鱗癌細胞后，發現外泌體中有472種蛋白質的豐度受到IR的顯著影響，其中包括425種上調的蛋白質和47種下調的蛋白質，這些蛋白質主要與細胞中的ROS代謝、DNA修復、染色質包裝和蛋白質折疊有關，反映了外泌體在細胞基因毒應激時發揮的作用。有人比較了IR后的神經膠質瘤細胞釋放的外泌體與正常培養的細胞釋放的外泌體中的蛋白質組，發現IR導致外泌體中的蛋白質的種類減少了將近700種，剩余的蛋白質直接或間接的參與細胞對IR的應激反應，如蛋白酶體途徑、Janus蛋白酪氨酸激酶(JAK)-STAT信號途徑和細胞周期調控，而且IR作用后細胞釋放的外泌體能在體外增強受體細胞的增殖能力和抗輻射能力[22]。Yentrapalli等[23]用全血樣本進行的實驗表明，受到輻射的血細胞分泌的外泌體具有調節免疫的能力，在這些外泌體中，關于急性期反映信號傳導、補體系統、IL-12信號傳導和巨噬細胞功能調節的蛋白質的豐度顯著增加。也有人報道了其他導致細胞基因毒應激的因素，如順鉑處理的卵巢癌細胞釋放的外泌體的直徑顯著小于正常細胞釋放的外泌體，而且順鉑處理的細胞釋放的外泌體能夠增強其他腫瘤細胞的侵襲性并能引起周圍細胞的旁觀者效應和對順鉑的抗性[24]。還有人分析了使用烷化劑替莫唑胺治療多行性膠質母細胞瘤患者的外周血中的外泌體，與正常人相比，GSC患者的外周血中的外泌體含量更高，而且外泌體與細胞黏附相關的蛋白質的含量也顯著增加，使腫瘤細胞更容易轉移和復發，最終導致臨床治療的失敗[25]。

5 營養應激對外泌體功能的影響

營養物質對于細胞正常生理功能和穩態的維持至關重要，葡萄糖對細胞是最重要的營養物，葡萄糖的不足和過量均會引起細胞應激。最近研究表明，外泌體也可能在葡萄糖相關疾病中發揮作用。Garcia等[26]發現大鼠心肌細胞H9C2細胞系以及大鼠原代培養的心肌細胞在低糖的情況下，外泌體的合成和分泌量會增加，低糖時產生的外泌體能將功能性葡萄糖轉運蛋白和糖酵解酶傳遞給內皮細胞，使內皮細胞的葡萄糖攝取能力、糖酵解活性和丙酮酸產生增加。也有學者研究了高糖應激下細胞分泌的外泌體的成分和功能的變化。Saez等[27]發現在高糖環境下培養的人臍靜脈血管內皮細胞釋放的外泌體的量會增加，并且通過增強內皮型一氧化氮合酶(eNOS)、人類陽離子型氨基酸轉運蛋白1型(hCAT-1)、VEGF和細胞內黏附分子1型(ICAM-1)蛋白的表達來增強內皮細胞傷口愈合的能力。另外，有學者發現高糖環境會增加腎小管內皮細胞外泌體的釋放量，同時導致足細胞的上皮—間質轉化和屏障功能障礙[28]。Ling等[29]發現高糖能增加腎小管內皮細胞釋放出富含circRNA的外泌體量，測序后顯示，這些外泌體中有217個circRNA的表達顯著下調和484個circRNA的表達顯著上調，高糖應激的腎小管上皮細胞釋放的外泌體能夠促進腎小管上皮細胞α-平滑肌肌動蛋白的表達，抑制腎小球系膜細胞的增殖并促進上皮—間質轉化。

6 結論

雖然現有的數據還遠遠不夠完善，但已經說明了外泌體在細胞應激反應中發揮著重要作用。現已發現，細胞應激時釋放的外泌體中的內容物發生了明顯的變化，但目前的研究還未找出細胞應激狀態下外泌體中共有的標志物。另外，在用相似的應激條件處理細胞所釋放的外泌體中的內容物也不盡相同，這種差異反映了不同的生物學模型(細胞類型和應激條件)以及所分析的外泌體的特定類型。盡管如此，在不同的生物學模型中的不同的外泌體，卻具有相似的生物學功能，對受體細胞產生相似的作用。現有的數據表明，在細胞應激時釋放的外泌體可能參與調節細胞的增殖和遷移，影響細胞的活力，改變細胞外環境以及血管生成等。解釋外泌體在介導細胞應激中的作用和機制，以及外泌體在細胞間通信中的作用和機制，仍需進一步的研究。