外泌體源性miRNAs在肝臟疾病發生發展中作用的研究進展

戢敏，陳星，喻雪琴，陳芳，梅怡晗，梅小平

(1川北醫學院附屬醫院，四川南充 637000；2首都醫科大學)

肝臟疾病的發病機制十分復雜，其涉及到的致病因素包括各種肝炎病毒、藥物、乙醇等，疾病到后期可進展為肝硬化、肝癌，對人類健康影響較大。肝組織活檢是某些肝臟疾病診斷的金標準，但其臨床應用有一定的局限性。近年來發現，外泌體及外泌體源性微小RNA(miRNAs)是由多種細胞分泌到細胞外的一種雙層囊泡小體(外泌體)及物質，起初外泌體被認為是一種人體內的代謝廢物，隨著研究的深入，人們發現外泌體具有豐富的作用，如細胞信號傳導、基因調控、免疫調節等。近年研究發現，外泌體及其外泌體源性miRNAs參與了肝臟疾病的發生發展，是肝臟疾病診治的潛在生物標志物，這為臨床上早期診斷與治療肝臟疾病提供了新思路?，F就外泌體源性miRNAs在肝臟疾病發生發展中的作用進行綜述。

1 外泌體源性miRNAs的生物學特征

外泌體是在1987年由Johnston等[1]在哺乳動物成熟紅細胞中發現的，其直徑為30～100 nm,密度為1.10～1.20 g/mL，可由B淋巴細胞、T細胞、樹突狀細胞、神經細胞等多種細胞釋放[2]，其在外周血、尿液、唾液、羊水及腹水等體液中均可檢出[3,4]。外泌體可攜帶蛋白質、細胞因子、轉錄因子受體、mRNA和miRNAs等多種生物活性物質，并可在體液中穩定表達與循環，具有物質轉運“載體”，細胞轉運和信號傳導作用，并且在機體的正常生理及病理過程中發揮調節作用，如抗原提呈、誘導腫瘤細胞的發生與遷徙、促進組織損傷后的愈合、靶細胞的活化、增殖、分化與凋亡、病毒的復制與抑制等[5]。Valadi等[6]在2007年研究發現：機體外泌體是由肥大細胞分泌產生的，可將miRNAs、mRNA以及mRNA翻譯產生機體生理與病理狀態所需要的蛋白質，及信號物質傳遞到靶細胞，從而初步認為，外泌體具有在細胞間選擇性地輸送RNA分子的功能，但其作用機制尚不清楚。有研究[7]發現，體液特別是外周血中的外泌體是miRNAs的主要來源，對miRNAs起保護作用，阻止其不受RNA酶的降解，使其能在體液中長時間穩定表達并被穩定地檢出。有研究顯示，不同肝臟疾病的多類型細胞都能分泌受外泌體產生與保護的miRNAs，在相應肝臟疾病細胞中miRNAs表達水平發生變化時，其受外泌體影響與保護的miRNAs也會出現同步變化，其miRNAs表達水平變化幅度比外泌體更大，這種現象稱為“miRNAs放大效應或海綿效應”。miRNAs是一段長度為19～23 nt的內源性非編碼單鏈分子，可與Ago2形成RNA誘導沉默復合體，以完全配對或不完全配對方式與mRNA的3′端非編碼區結合發揮降解或沉默靶細胞中mRNA的表達。血清、血漿、尿液、乳汁等體液中存在著大量的miRNAs,其循環體液中miRNAs譜的異常表達與許多疾病的發生發展密切相關[8]，并且體液中的miRNAs能作為某些疾病診斷的新型標志物與治療靶標[9]。

2 外泌體源性miRNAs在肝臟疾病發生發展中的作用

2.1 外泌體源性miRNAs在脂肪性肝病發生發展中的作用 肝細胞通過外泌體可誘導細胞因子表達水平發生變化,從而發揮機體免疫誘導與調節作用，進而調控肝組織炎癥反應的發生與發展。在我國，脂肪肝多分為酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝(NAFLD)。有研究[10]發現，酒精性脂肪肝小鼠外周血中外泌體高表達，采用miRNA芯片研究也顯示，酒精性脂肪肝小鼠的外周血及肝組織中miRNAs高表達。Saha等[11]研究發現，乙醇可以誘導人單核細胞釋放富含miRNA-27a的外泌體，而外泌體可刺激原始單核細胞的極化或提高其活性，使原始單核細胞分化為M2巨噬細胞，誘導炎性因子分泌與高表達，增強巨噬細胞的吞噬功能。另一項研究[12]顯示，乙醇誘導肝細胞分泌的外泌體，其釋放與激活半胱天冬酶3依賴的通路有關，而該外泌體中含有的CD40配體能夠促使巨噬細胞的活化，誘導和促進酒精性肝病的炎性反應。NAFLD和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者分泌的外泌體，主要是由自然殺傷T細胞和巨噬細胞產生。NAFLD小鼠模型囊泡中miRNAs表達明顯增加，表達模式多樣化[13]。研究結果顯示，病理狀態下的細胞能誘導獨特物質囊泡水平高表達，從而誘導疾病的病理生理變化過程。脂質高水平表達可誘導原代肝細胞和肝癌細胞系Huh7細胞囊泡的釋放，并活化巨噬細胞，促進炎癥反應的發生，從而引發NASH[14]。此外，膽堿缺乏L-氨基酸(CDAA)喂養小鼠分泌的外泌體中miR-122、miR-192高表達。在NAFLD進展期間，囊泡中的miRNAs隨時間推移表達逐漸增高，而在肝臟中逐漸呈現低表達。這些研究表明，miRNAs在肝臟病理生理學中發揮了重要的調控作用，miRNAs在肝臟疾病中的表達水平差異和模式是不相同的，其發生機制有待進一步研究。

2.2 外泌體源性miRNAs在慢性肝炎發生發展中的作用 外泌體源性miRNAs在慢性肝炎的發生發展中起到了雙刃劍的作用。一方面，外泌體源性miRNAs能影響機體的免疫反應，HBV感染肝實質細胞后，誘導肝細胞的正常生理病態化，外泌體源性miRNAs包裹的蛋白質參與了肝細胞的正常代謝調節；同時，HBV感染肝細胞后誘導分泌的外泌體源性miRNAs具有致病信號的傳遞作用，外泌體源性miRNAs可能參與病毒間或病毒與靶細胞間相關信息的傳遞作用以及疾病的發生發展與免疫調節過程[15]，從而使外泌體源性miRNAs成為HBV等病毒傳播的路徑[2]。Kouwaki等[16]研究發現，感染HBV的肝細胞能釋放含有HBV核酸的外泌體源性miRNAs，能誘導巨噬細胞高表達與NK細胞及配體的激活作用，在NK細胞激活后，進而促進機體在病毒感染初期誘導產生IFN-γ并高表達，以促進肝細胞核中HBV核酸的降解與清除，達到抗病毒作用。然而有研究[17]顯示，慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血中含HBV的外泌體源性miRNAs起負性調節作用，這種外泌體源性miRNAs能誘導和促進NK細胞水平下降與功能受損，導致IFN-γ水平下降；對NK細胞的增殖和存活發揮抑制作用，是HBV逃逸宿主固有免疫的主要發生機制。通過對20例CHB患者外周血外泌體源性miRNAs研究比較發現，其外泌體源性miRNAs表達水平上調的有：miR-18a、miR-221、miR-222和miR-224，下調的有：miR-101、miR-106b、miR-122、miR-195，但也有外泌體源性miRNAs表達無顯著性變化的[18]，如miR-21等。還有研究顯示，HCV感染肝細胞后分泌的外泌體源性miRNAs包裹病毒RNA，而這些外泌體源性miRNAs可進一步感染新的肝細胞，提示外泌體源性miRNAs在HCV感染擴散過程中也具有非常重要的再感染作用[19]。有學者研究發現，HCV感染的肝實質細胞分泌的外泌體源性miRNAs中包含有miR-19a，其可直接激活肝星狀細胞(HSC)的STAT3-TGF-β信號通路，誘導和促進肝組織纖維化的發生發展[20]。

2.3 外泌體源性miRNAs在肝纖維化及肝硬化發生發展中的作用 肝纖維化是各種因素導致肝細胞間細胞外基質(ECM)過度沉積的一種病理狀態，它與HSC活化、增殖、分化與凋亡密切相關。外泌體源性miRNAs能調節HSC的活化、增殖、分化、凋亡及遷移，誘導活化的HSC數量與功能增加，這在肝纖維化發生發展過程中起到了關鍵的調控作用。Seo等[21]研究發現，肝細胞損傷后可以分泌含有Toll樣受體3配體的外泌體源性miRNAs，激活HSC的Toll樣受體3，誘導和促進γδ T淋巴細胞分泌大量的IL-17A，高表達的IL-17A能誘導和促進肝纖維化的形成。Charrier等[22]研究發現，激活后的HSC能分泌含有結締組織生長因子(CTGF)2的外泌體源性miRNAs，并在HSC之間發揮信號通路的傳遞作用。α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)是HSC活化的標志蛋白，外泌體源性miRNAs能促進α-SMA和膠原纖維的高表達，促進肝纖維化的發生與形成。外泌體源性miRNAs除了能調節HSC活化外，還與HSC遷移關系密切。動物實驗結果顯示，四氯化碳誘導建立形成的肝纖維化或肝硬化小鼠，外周血中外泌體源性miRNAs高表達，可促進HSC活化、增殖與ESM的形成；這可能與外泌體中的鞘氨醇激酶1/鞘氨醇-1-磷酸酯在HSC的活化、增殖與ESM的形成及遷移過程中所發揮的關鍵性作用相關[23]。在肝纖維化與肝硬化患者中，竇內皮細胞數量減少與功能失衡將會導致門脈高壓。研究發現，HSC能夠釋放含有Hedgehog配體的外泌體源性miRNAs到竇內皮細胞，誘導竇內皮細胞數量與功能失調，初步認為外泌體源性miRNAs可誘導和促進肝纖維化與肝硬化所致的門脈高壓的發生。另外，也有研究顯示，來源于原發性膽汁性肝硬化外周血中的外泌體源性miRNAs能選擇性地誘導不同亞群抗原遞呈細胞共刺激分子的高表達[24]，這也可能是導致肝硬化及門脈高壓發生的又一原因。外泌體源性miRNAs中的miR-214表達下調明顯，推測miR-214可能是一種潛在的診斷肝組織纖維化的標志物之一，但miR-214在肝組織發生纖維化中表達下調機制尚不明確，有待進一步研究[25]。

2.4 外泌體源性miRNAs在肝癌發生發展中的作用 Sohn等[26]研究發現，與肝硬化患者比較，原發性肝癌(HCC)患者外周血中外泌體源性miRNAs表達升高明顯，其中高表達的有：miR-18a、miR-221、miR-222和miR-224，低表達的有：miR-101、miR-106b、miR-12和miR-195。有研究發現，肝癌組織中miRNA-10b的表達與預后呈正相關，同時miRNA-10b、miRNA-200A和miRNA-122與肝硬化的形成關系密切，具有調節上皮間質轉化與ECM形成的作用，進而誘導和促進了肝硬化的發生與發展；認為miRNA-10b、miRNA-200A和miRNA-122的表達高低可作為診斷肝硬化相關肝癌的標志物之一[27]。研究發現，miR-21在肝纖維化、肝硬化、肝癌等疾病中是一種具有疾病鑒別診斷意義較高的外泌體生物標志物，具有與miR-122作用相反的功能。miR-122是在肝組織中豐度表達最高的miRNA,參與了肝臟組織的脂質代謝過程[28]，miR-122在部分肝癌組織中表達下調，且與肝癌患者預后、復發與轉移關系密切[29]。同時有研究發現，miR-21在肝癌的發生中具有重要的調控作用，在肝癌患者腫瘤組織內異常高表達，且miR-21高表達預示肝癌患者的生存期更短[30,31]。有研究比較了30例HCC患者與30例慢性HBV感染患者的外周血miR-21表達水平，發現HCC患者外周血中miR-21表達異常增高；另外一項研究比較了20例肝癌患者和20例CHB患者的外泌體源性miRNAs發現：盡管在肝癌及CHB患者外周血中miR-21的表達沒有顯著性差異，但肝癌患者miR-18a、miR-221、miR-222和miR-224表達較CHB患者明顯上調，而miR-101、miR-106b、miR-122和miR-195表達明顯下調[23]。這些研究表明，外泌體源性miRNAs在肝臟疾病中表現多樣和不穩定，有待進一步研究表達水平穩定并具有特異性的外泌體源性miRNAs來作為HCC等肝臟疾病的標志物。

目前，肝組織活檢仍然是診斷肝臟疾病的金標準，而對外泌體及其內容物的研究，為肝臟相關疾病提供了無創檢查的可能，有希望應用于肝臟疾病的早期診斷以及藥物療效的檢測。此外，外泌體源性miRNAs靶向細胞作用機制尚不明確，因此外泌體源性miRNAs所介導細胞間的信號通路激活與抑制仍是今后研究的方向之一。