DNA損傷修復基因Eme1在腫瘤發生及放化療調控中作用的研究進展

鄧于紅，徐祖敏

(廣東醫科大學附屬醫院，廣東湛江 524000)

DNA是生物遺傳信息的主要載體，因此保持DNA的完整性和穩定性對細胞的延續及其發揮正常的生理功能具有非常重要的意義。基因組DNA面臨各式各樣的損傷，面對這些損傷機體如果不能及時正確地修復，可能導致基因組不穩定甚至腫瘤的發生。為了維持基因組的穩定性，生物在進化過程中逐步建立出一套完整而精密的損傷應答系統來監控和修復DNA損傷。DNA損傷的原因有內源性(例如細胞代謝過程產生的活性氧自由基)和外源性(包括電離輻射、化學藥物等)[1,2]，根據損傷類型可分為DNA雙鏈斷裂和DNA單鏈斷裂[3]。DNA損傷的后果短期可出現生理功能紊亂、異常增生和代謝、細胞死亡，長期效應則有腫瘤的發生、老化、疾病。雙鏈斷裂是DNA損傷的主要形式，其修復方式主要有同源重組和非同源末端連接修復[4]，兩者可相互協調共同完成DNA雙鏈斷裂的修復[2,5]。真核生物中DNA雙鏈斷裂修復的主要通路是同源重組[6]，DNA損傷修復基因Eme1編碼的蛋白質參與了DNA雙鏈斷裂的同源重組修復過程[7,8]。Eme1與Mus81可形成異二聚體蛋白質復合物，作為結構特異性核酸內切酶起作用，在DNA雙鏈斷裂修復及異常Holiday連接、復制叉結構、D-loops等的切除過程中發揮了重要作用。正常細胞具有復雜的DNA損傷修復反應途徑,其激活可引起細胞周期停滯、細胞凋亡或者細胞衰老，還可抑制細胞癌變的發生，而腫瘤細胞中的DNA損傷修復反應的激活可能導致對放化療不敏感。近年來研究發現，Eme1與多種惡性腫瘤的發生發展相關，且可能參與腫瘤放化療敏感性的調控過程。現就Eme1在DNA損傷修復中的作用及其與腫瘤易感性、放化療敏感性等的關系進行綜述。

1 Eme1基因及其編碼蛋白的結構

人類Eme1基因位于細胞核17號染色體長臂q21,33，序列總長度為20 kb，包含9個外顯子，屬于EME1/MMS4家族，編碼的Eme1蛋白由583個氨基酸構成，相對分子質量為65 kDa[9]。其結構包括一個中心核酶活性區，C末端有兩個重復的螺旋—發夾—螺旋(HhH)模序結構、一個螺旋接頭和一個柔性結構域內接頭組成，C末端區域對于Eme1的DNA修復功能是必需的，可識別DNA及與Mus81結合，輔因子為Mg2+[10]。Mus81蛋白通過其N端與細胞核固定，并利用其C端與Eme1蛋白結合形成異源二聚體。Mus81蛋白的結合蛋白在釀酒酵母中為Mms4，在粟酒裂殖酵母和哺乳動物中為Eme1[11]。Eme1/Mms4是Mus81發揮核酸內切酶活性的必要條件。Eme1與Mms4蛋白質只有少量的序列相似性，這主要局限于它們的C端包含一個假定存在的HhH模序結構和有缺陷的核酸酶結構域，而這個區域對與Mus81蛋白的結合是重要的，也有助于與DNA的結合[12]。Eme1蛋白在成人許多組織和胚胎發育的不同階段普遍表達[13]。

2 Eme1的功能

2000年，Boddy等[14]在酵母菌中首次鑒定得到Mus81基因，并稱之為“對乙烷磺酸鹽及紫外線敏感的第81號獨立序列”，發現Mus81在DNA重組修復中可識別、促進乙烷磺酸鹽和紫外線引起的DNA損傷或參與損傷耐受過程。2001年，Boddy等[15]又在裂殖酵母中發現Eme1蛋白通過與Mus81蛋白的C末端相連，共同將DNA形成的Holliday交叉解離為線性雙螺旋結構，并證明Eme1和Mus81是核Holliday交叉解離酶的亞基。在有絲分裂和減數分裂的重組過程中，以及DNA雙鏈斷裂時的同源重組途徑中會出現由四條DNA單鏈構成的中間體，即Holliday交叉結構，這個結構的解螺旋對于染色體的精確分離起著重要作用。Mus81-Eme1復合物可以解螺旋帶有切口的Holliday交叉結構，產生基因轉換的修復產物。后續研究還發現，Mus81-Eme1復合物組成的異二聚體核酸內切酶，在分解一些DNA結構,如復制叉、3構游離末端中起作用，可促進DNA修復，保持基因組穩定性[12,13,16]。DNA復制過程中產生的復制叉在遇到一些自然程序障礙物或偶然發生障礙物時可受阻，如遇rDNA間隔區內的終止位點時可發生DNA復制叉的自然受阻，偶然發生障礙物有一系列DNA損傷劑、DNA二級結構、模板DNA內的拓撲應力和DNA-蛋白質復合物等，此外，復制叉還可因一些復制蛋白和復制底物耗盡而受阻。停滯的復制叉可以通過非同源重組或同源重組途徑來修復[9]。同源重組在處理停滯、受阻和受損的復制叉中起重要作用，停滯的復制叉中間體可被核酸內切酶裂解形成雙鏈斷裂結構，繼而通過同源重組途徑修復，而Mus81-Eme1/Mms4則通過啟動同源重組發揮裂解停滯或受阻復制叉的作用[17]。2003年，人類同源Eme1基因被克隆，并發現人體內Mus81-Eme1核酸內切酶對合成的復制叉和3′游離末端特異性更高，而對Holliday交叉的解離能力較低[9]。Holliday交叉裂解的效率可以通過引入特異的同源序列來增強[18]。真核生物細胞DNA受到損傷時一方面可誘導修復基因的轉錄，另一方面還可啟動細胞周期檢查點對DNA損傷作出應答反應，暫時阻斷細胞周期的進程，防止受損DNA的繼續復制，如果損傷無法修復，則可誘導細胞進入凋亡。Mus81-Eme1可通過多種檢查點通路參與DNA雙鏈斷裂的修復。Mus81-Eme1缺失可通過ATM-Chk2通路激活細胞周期G2/M檢查點，越過S期檢查點的DNA雙鏈斷裂、G2期形成的雙鏈斷裂可激活細胞周期G2/M檢查點。如果復制叉停滯未經處理而形成DNA雙鏈斷裂，則可經ATM依賴的通路激活細胞周期檢查點[11]，表明Mus81-Eme1復合體在細胞周期檢查點，以及DNA修復、重組和復制過程發揮作用[13]。有研究對處于分裂中期的細胞用秋水仙堿處理后發現，敲除一個等位基因的Eme1+/-細胞出現染色單體和染色體畸變如缺口、斷裂的概率比野生型細胞大，證實了Eme1參與維持染色體穩定性[11]。染色體脆性位點是染色體上隨機的斷裂點，它的存在預示著染色體的不穩定性，腫瘤細胞的染色體重排和缺失常常發生在這些脆性部位，這些不穩定的染色體及其脆性位點像基因一樣可以遺傳，有些脆性位點也是致癌劑敏感點和癌基因同位點，在某些因素作用下，脆性位點的敏感性和不穩定性升高，致使染色體發生突變、重排、丟失和斷裂等，從而導致細胞內重要基因(癌基因、抑癌基因、DNA修復基因)發生變異，最終導致細胞癌變和腫瘤發生。而Mus81-Eme1結構特異核酸內切酶在細胞有絲分裂早期可與基因脆性位點結合，促使脆性位點在染色體中期出現特征性缺口或斷裂的細胞學特征，主動的使染色體及時分離來保持基因組的完整性[19]。

3 Eme1與腫瘤易感性

DNA修復分子在維持遺傳穩定性方面是非常重要的，許多人類疾病是由基因決定的，與體細胞基因突變或遺傳變異有關[20]。腫瘤是外因與內因相互作用導致的一類疾病，許多外界致病因素的致癌作用都是使基因發生突變累積致病，而突變主要發生在三類基因：癌基因、抑癌基因、DNA修復基因。這些基因原本在細胞中行使正常的生物學功能，然而因某些致病因素的作用，這些基因可發生突變、插入、擴增、缺失或甲基化狀態的改變。機體能啟動多種修復DNA損傷的途徑在一定限度內克服不利作用，使機體免于產生疾病。近年來在對腫瘤的研究中發現，Eme1可能與腫瘤易感性有關。Eme1編碼區基因變異導致氨基酸的改變，可能造成Eme1蛋白與DNA的異常結合或不能與Mus81相互作用，從而增加腫瘤的遺傳易感性[10]。已有研究報道Eme1遺傳變異與幾種腫瘤的發生有關，目前認為,不同個體DNA修復能力有差異且是由遺傳決定的,這種差異性可能是DNA修復通路中的某些核心基因的單核苷酸多態性與環境因素的綜合作用引起的。我國有研究者采用病例—對照研究的方法驗證了Eme1基因遺傳變異與中國南方人群肺癌發病存在關聯，該研究顯示Eme1 Ile350Thr(T>C)位點變異在肺癌組與健康對照組中的分布差異有顯著性，攜帶Ile/Thr基因型個體發生肺癌的危險性是Ile/Ile基因型攜帶者的1.44倍，攜帶Thr/Thr基因型個體發生肺癌的危險性是Ile/Ile基因型攜帶者的1.44倍，Ile350Thr Thr變異基因型(Ile/Thr和Thr/Thr)患肺癌的危險性顯著上升，且肺癌的發病風險與Thr等位基因(allele)個數存在顯著的劑量反應關系[21]。Chang等[22]在研究了10 177個非同義突變cSNP與人類多形性膠質母細胞瘤的關系后發現，Eme1 Ile350Thr的遺傳變異很可能與多形性膠質母細胞瘤的發生有關聯。后來又有研究者在2013年[23]通過748例乳腺癌患者和778例正常對照的病例對照研究發現，中國南方女性Eme1 Thr變異可增加患乳腺癌的風險和促進乳腺癌早發，并呈蘇氨酸等位基因依賴的劑量反應方式，而Glu69Asp變異與乳腺癌發病風險無明顯關聯，并指出Ile350Thr位點位于第二個HhH模序結構，這是與DNA結合的核酸酶活性所必需的結構。Ile350Thr變異屬于外顯子剪接增強子(ESES)，該變異可能會影響Eme1選擇性剪接造成DNA的異常轉錄。Eme1基因的一個重要作用是通過對Mus81與DNA底物的特異結合的影響來保持基因組的穩定性[10]，研究表明，假如Eme1缺失，Mus81亦失去剪切活性[24]。因此該多態位點很可能通過氨基酸的改變，改變蛋白質的空間構象，影響Eme1與Mus81和DNA底物的特異結合，從而使基因的功能受到影響，導致腫瘤易感性增強。雖然具體機制有待進一步探討，但這些研究表明，Eme1基因Ile350Thr位點遺傳變異可能作為腫瘤易感性及發病早期的遺傳標記。Eme1單核苷酸多態性還可能與兒童腦腫瘤、白血病和其他腫瘤的發生有關[25]。

4 Eme1在腫瘤放化療敏感性調控中的作用

放化療是臨床上腫瘤治療的主要方案，其是利用放化療誘導腫瘤細胞DNA損傷，DNA損傷后啟動的信號通路會導致細胞死亡來殺死癌細胞。放化療對腫瘤細胞DNA的損傷類型主要有：DNA鏈斷裂、DNA堿基損傷、DNA交聯等。然而，DNA損傷修復也是腫瘤治療抵抗的一種機制。Eme1作為DNA損傷修復過程參與者之一，其功能的變化可能影響腫瘤細胞的放化療敏感性。DNA分子損傷最早是從研究紫外線的效應開始的，早期在對酵母的研究中即發現，Eme1和Mms4基因突變可導致細胞對紫外線輻射和羥基脲敏感，而對電離輻射不敏感或輕度敏感[8,26]。2003年，Abraham等[13]為了研究Eme1在哺乳動物體內的生物學功能，應用基因敲除技術建立了Eme1基因缺失的小鼠模型：只敲除一個等位基因的Eme1+/-小鼠和兩個等位基因都被敲除的Eme1-/-小鼠，發現Eme1-/-細胞和野生型ES細胞相比生存活力或生長速率無差異。由此提示，正如在粟酒裂殖酵母和釀酒酵母中所觀察到的，哺乳動物Eme1對于胚胎干細胞的存活和生長不是必要的，且通過比較兩個等位基因都被敲除的Eme1-/-和野生型胚胎干細胞對DNA損傷劑(電離輻射、紫外線照射、羥基脲、順鉑和絲裂霉素C)的敏感性發現，與野生型對照組相比，Eme1功能缺失的胚胎干細胞對絲裂霉素C和順鉑(致DNA鏈間交聯藥物)濃度增加的敏感性很高，而Eme1-/-胚胎干細胞則對電離輻射、紫外線照射、羥基脲治療輕度敏感，因此推斷出哺乳動物胚胎干細胞Eme1基因在絲裂霉素C和順鉑誘導的DNA損傷修復中必不可少，也一定程度地參與了電離輻射、紫外線照射和羥基脲治療的DNA損傷修復。后來Hiyama等[11]在人類結腸癌細胞系HCT116中證實，人類細胞中Eme1對DNA交聯劑引起的損傷也有抵抗作用，原因可能是DNA交聯劑可造成復制叉停滯，而Mus81-Eme1結構選擇性核酸內切酶能修復和重新啟動停滯的復制叉從而出現對DNA交聯劑的耐受。Tomoda等[27]在同樣的細胞系中發現，Eme1也參與對順鉑敏感性的調控，再次證實了Eme1可修復DNA交聯劑引起的損傷。Tomoda等檢測了DNA交聯劑損傷修復蛋白Eme1、Mus81、ERCC1和Rad51在結直腸癌、乳腺癌及肺癌等9種惡性腫瘤的18株細胞系中的表達水平，并分析了不同腫瘤細胞系對順鉑的敏感性，然后選擇其中10株細胞系檢測了順鉑治療后的細胞存活數，發現順鉑敏感性與Eme1水平的相關性大于與RAD51、MUS81水平的相關性，且Eme1水平與細胞對順鉑的敏感性之間存在一個規律，即Eme1水平低的細胞對順鉑敏感性高，而Eme1水平高的細胞對順鉑敏感性低。已有研究表明，ERCC1和Rad51蛋白可作為順鉑耐藥的標志物，而Mus81-Eme1核酸內切酶復合物在DNA交聯劑損傷修復過程中是XPF-ERCC1復合物的上游分子[28]，提示通過Eme1表達水平來預測對順鉑的敏感性比ERCC1和Rad51準確性更高[27]。順鉑及其類似物是腫瘤治療中常用的化療藥物，而多項研究結果表明Eme1參與了化療敏感性的調控，因此以Eme1作為化療敏感性的潛在標志物成為可能。Vigneron等[29]的研究發現西妥昔單抗可促進DNA損傷反應通路的激活，并可抑制DNA修復過程中Eme1的降解，從而增強DNA的損傷修復能力。因此，當使用西妥昔單抗作為抗腫瘤藥物時應該考慮這個方面，并且表明Eme1可作為預測西妥昔單抗耐藥的標志物。雖然Eme1調控化療敏感性的具體機制尚不明確，而Eme1調控放療敏感性國內外目前尚無相關研究，但抑制Eme1介導的DNA損傷修復能否提高放療和DNA損傷化療的療效仍值得我們進一步探究，以及以Eme1為靶點研發逆轉腫瘤放化療耐受的新措施仍有希望。

DNA損傷修復對避免基因組的不穩定、腫瘤和細胞死亡的發生是至關重要的，決定細胞命運的不僅是損傷嚴重程度，其修復能力和修復機制亦十分重要。Eme1作為DNA損傷修復基因之一，又參與腫瘤放化療敏感性的調控，其結構及功能的改變可能導致腫瘤的發生發展和放化療敏感性的變化。因此，明確Eme1在腫瘤中的表達、變異特點和作用機制，及其是否直接影響以及如何影響腫瘤的發生、演進過程和放化療療效值得進一步研究，并有望為腫瘤的早期診斷和預后評估提供新的分子標志物，也可為腫瘤復發轉移的防治及提高放化療敏感性提供潛在的藥物作用靶點。