NEDD4基因沉默對膀胱癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

楊傳來,李巧巧,夏任蘭,孫興偉

(蘇州大學附屬第二醫院,江蘇蘇州 215004)

膀胱癌是常見的泌尿系統惡性腫瘤，發病率居我國泌尿系統惡性腫瘤第一位[1]。膀胱癌的病因較復雜，既有遺傳因素，又有外界環境的影響，其中吸煙[2]和芳香胺類化學物質[3]是膀胱癌的誘因。臨床治療膀胱癌的標準是膀胱切除術配合化療與放療，但術后復發和轉移率仍較高[4]。一旦膀胱癌出現復發和轉移，其2年病死率極高。神經前體細胞表達下調因子4(NEDD4)是一種E3泛素連接酶，其主要下游靶蛋白包括PTEN[5]、p53[6]、p73[6]、LATS1[7]、VEGFR2[8]等。研究[9]表明，NEDD4在人類癌癥發生和惡性進展中發揮關鍵作用。研究發現，NEDD4在胰腺癌[10]、乳腺癌[11]、結直腸癌[12]和膀胱癌[13]中均呈高表達。盡管NEDD4在多數腫瘤中呈高表達并能促進腫瘤的發生，然而其在膀胱癌中的研究較少。2019年1月，我們探討了NEDD4基因沉默對膀胱癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人膀胱癌細胞T24和RT4購自American Type CultureCollection(ATCC)。MTT購自Sigma公司(USA)。Lipofectamine 2000、TRIzol購自Invitrogen公司(USA)。逆轉錄試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購自Thermo公司(USA)。SYBR green PCR master mix購自Applied Biosystems公司(USA)。抗Tubulin單克隆抗體購自Sigma公司。抗NEDD4抗體購自Cell Signaling Technology公司(USA)。靶向NEDD4的siRNA(NEDD4siRNA-1、NEDD4siRNA-2、NEDD4siRNA-3)由蘇州吉瑪基因公司合成。實時RT-PCR引物由蘇州金唯智生物有限公司合成；其余試劑均為國產分析純。

1.2 靶向NEDD4的siRNA合成 NEDD4siRNA-1正向引物：5′-CCUAACAGAUGCUGAGAAUTT-3′，反向引物：5′-AUUCUCAGCAUCUGUUAGGTT-3′；NEDD4siRNA-2正向引物：5′-GCAAGGAUUCCUUCCUAAATT-3′，反向引物：5′-UUUAGGAAGGAAUCCUUGCTT-3′；NEDD4siR-NA-3正向引物：5′-GGAGAAUUAUGGGUGUCAATT-3′，反向引物：5′-UUGACACCCAUAAUUCUCCTT-3′。同時合成Negitive Control siRNA作為陰性對照，正向引物：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反向引物：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。每組siRNA用DEPC水溶解，并稀釋成濃度為20 μmol/L的溶液，儲存于-20 ℃冰箱備用。

1.3 細胞培養、分組及siRNA轉染 人膀胱癌細胞T24和RT4常規培養于含10%FBS、100 U/mL雙抗的DMEM培養基中并置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養。每2～3 d用0.25%胰酶消化、傳代。轉染前24 h將細胞接種于6孔板中，當細胞融合度約70%時換無雙抗、無血清的DMEM培養基。設立空白對照組、陰性對照組和實驗組，參照Lipofectamine 2000說明書的操作步驟和量將NEDD4siRNA-1、NEDD4siRNA-2、NEDD4siRNA-3、Negitive Control siRNA轉入細胞中，空白對照組為野生型T24和RT4細胞，不予轉染；陰性對照組細胞轉染Negative Control siRNA，實驗組細胞轉染NEDD4siRNA-2。轉染4 h后更換為含有10%FBS的培養基繼續培養，48 h后提取細胞RNA和蛋白質。

1.4 NEDD4的mRNA和蛋白表達檢測 采用RT-PCR法和Western blotting法。收集轉染后的T24和RT4細胞，用TRIzol試劑法提取各組細胞的總RNA，并利用逆轉錄試劑盒逆轉錄獲得cDNA。隨后以此cDNA為模板，進行RT-PCR，根據人NEDD4基因和內參GAPDH基因設計引物為NEDD4：正向引物5′-GAAGATCTACCATGGCAGCCGACGACACTGAG-3′,反向引物：5′-CGGAATTCT CAATCAACCCCATCAAAGCCCTG-3′；GAPDH：正向引物5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′,反向引物：5′-CAGTGAGCT TCCCGTTCAG- 3′。PCR反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s；58 ℃ 20 s；70 ℃ 10 s，40個循環。各組重復檢測3次，以2-ΔΔCt法計算各基因相對表達量。消化收集轉染后的T24和RT4細胞，加入細胞裂解液提取細胞總蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，用10%的SDS-PAGE膠將提取的40 μg總蛋白進行電泳分離，然后半干法轉PVDF膜，封閉1 h，加入1∶1 000的抗Tubulin和NEDD4的一抗稀釋液4 ℃孵育過夜，第2天將膜取出用TBST液洗滌3次后孵育羊抗兔HRP標記二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h后用TBST液洗滌3次。將ECL顯影液的A液與B液按照1∶1混合。并反復滴加到NC膜上，將膠片放在NC膜上，緊扣暗匣子，用洗片機對其顯影。用Image J軟件分析蛋白電泳條帶灰度值，并計算NEDD4蛋白的相對表達量。

1.5 細胞增殖率測算 采用MTT法。收集對數生長期的T24和RT4細胞，稀釋成密度為6×104/mL的細胞懸液，各取100 μL接種于96孔板中。24 h后當細胞融合度約70%時換無雙抗、無血清的DMEM培養基。設立空白對照組、陰性對照組和實驗組，參照Lipofectamine 2000說明書的操作步驟和量將siRNA轉入細胞中，空白對照組為野生型T24和RT4細胞，不予轉染；陰性對照組細胞轉染Negative Control siRNA，實驗組細胞轉染NEDD4siRNA-2。轉染4 h后更換為含有10%FBS的培養基繼續培養48 h或72 h。每孔加入MTT 20 μL，混勻，再繼續孵育4 h，棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，充分混勻后用酶標儀檢測490 nm 波長處吸光度值。每組設置3個平行孔，實驗重復3次。

1.6 細胞遷移率測算 采用細胞劃痕實驗。設立空白對照組、陰性對照組和實驗組，空白對照組為野生型T24和RT4細胞，不予轉染；陰性對照組細胞轉染Negative Control siRNA，實驗組細胞轉染NEDD4siRNA-2。將轉染后的T24和RT4細胞消化、計數并以每孔5×104個細胞接種于24孔板內，每組設置3個平行孔。劃痕后0和20 h分別觀察拍照，計算細胞遷移率。細胞遷移率=(1-20 h時劃痕寬度/初始劃痕寬度)×100%。實驗重復3次。

1.7 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell侵襲實驗。設立空白對照組、陰性對照組和實驗組，空白對照組為野生型T24和RT4細胞，不予轉染；陰性對照組轉染Negative Control siRNA，實驗組轉染NEDD4siRNA-2。胰酶消化轉染后的T24和RT4細胞，低速離心。用無血清培養基重懸，并稀釋至1×105/mL，取200 μL細胞加入到Transwell上層小室，并在下層小室內加入500 μL含有10%FBS的培養基作為趨化因子。將帶有Transwell小室的24孔板置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養。20 h后取出培養板，吸棄上室內培養基，用棉簽小心擦去上表面未侵襲的細胞和Matrigel，用眼科剪和鑷子剪取基底膜，置于新的24孔板內，用PBS小心沖洗1次，侵襲的細胞用吉姆薩染液染色并用OLYMPUS生物智能導航儀拍照，隨機選取6個不同視野進行細胞數統計。實驗重復3次。

1.8 NEDD4蛋白及其下游靶蛋白PTEN和p73表達檢測 取T24和RT4細胞，設立空白對照組、陰性對照組和實驗組，空白對照組為野生型T24和RT4細胞，不予轉染；陰性對照組細胞轉染Negative Control siRNA，實驗組細胞轉染NEDD4siRNA-2。轉染48 h后提取蛋白質，消化收集轉染后的T24和RT4細胞，加入細胞裂解液提取細胞總蛋白。用BCA試劑盒測定蛋白濃度，用10%的SDS-PAGE膠將提取的40 μg總蛋白進行電泳分離，然后半干法轉PVDF膜，封閉1 h，加入1∶1 000的抗Tubulin、NEDD4、PTEN和p73的一抗稀釋液，4 ℃孵育過夜，第2天將膜取出，用TBST液洗滌3次，孵育羊抗兔HRP標記二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h后用TBST液洗滌3次。將ECL顯影液的A液與B液按1∶1混合。并反復滴加到NC膜上，將膠片放在NC膜上，緊扣暗匣子，用洗片機對其顯影。用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，并計算NEDD4、PTEN和p73蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 各組NEDD4的mRNA和蛋白表達比較 三條靶向NEDD4的siRNA均能下調細胞內NEDD4 mRNA和蛋白表達，其中siRNA-2片段干擾效率最高，差異有統計學意義(P<0.001)。在T24細胞中，陰性對照組、空白對照組、NEDD4siRNA-1組、NEDD4siRNA-2組、NEDD4siRNA-3組NEDD4 mRNA的相對表達量分別為1.03±0.11、1.00±0.13、0.33±0.06、0.20±0.06、0.52±0.05，蛋白相對表達量分別為1.08±0.04、1.00±0.05、0.51±0.07、0.15±0.02、0.33±0.03。在RT4細胞中，陰性對照組、空白對照組、NEDD4siRNA-1組、NEDD4siRNA-2組、NEDD4siRNA-3組NEDD4 mRNA的相對表達量分別為0.97±0.07、1.00±0.11、0.39±0.03、0.30±0.07、0.65±0.08，蛋白相對表達量分別為0.87±0.02、1.00±0.07、0.41±0.04、0.34±0.03、0.46±0.03。

2.2 各組細胞增殖率比較 T24細胞轉染48 h時空白對照組、陰性對照組、實驗組細胞增殖率分別為100.00%± 8.00%、96.67%± 3.22%、65.02%±5.03%，72 h時分別為100.00%±12.00%、92.12%±5.30%、41.33%±6.35%，與陰性對照組相比，實驗組細胞增殖率降低(P均<0.01)。RT4細胞轉染48 h時空白對照組、陰性對照組、實驗組細胞增殖率分別為100.00%±10.40%、91.04%± 6.25%、 64.98%±9.54%，72 h時分別為100.00%±15.12%、92.67%±5.51%、41.33%±10.02%，與陰性對照組相比，實驗組細胞增殖率降低(P均<0.01)。

2.3 各組細胞遷移率比較 轉染后20 h空白對照組、陰性對照組、實驗組T24細胞遷移率分別為76%±9%、71%±10%、31%±4%，RT4細胞遷移率分別為70%±4%、66%±4%、35%±2%，與陰性對照組相比，實驗組細胞遷移率降低(P均<0.01)。

2.4 各組細胞侵襲能力比較 空白對照組、陰性對照組、實驗組T24侵襲細胞數分別為(48.67±3.06)、( 45.67±1.53)、(26.67±1.16)個/視野，RT4侵襲細胞數分別為(60.33±3.06)、(56.33±2.86 )、(28.00±4.00)個/視野，與陰性對照組相比，實驗組侵襲細胞數降低(P均<0.01)。

2.5 各組NEDD4蛋白及其下游靶蛋白PTEN和p73表達比較 空白對照組、陰性對照組、實驗組T24細胞中NEDD4蛋白相對表達量分別為0.99±0.04、0.96±0.02、0.44 ±0.01，PTEN蛋白相對表達量分別為 1.01±0.08、1.29±0.06、4.15±0.10，p73蛋白相對表達量分別為0.99±0.04、1.08±0.05、3.97±0.06，與陰性對照組相比，實驗組NEDD4蛋白及其下游靶蛋白PTEN和p73表達均增加(P均<0.001)。空白對照組、陰性對照組、實驗組RT4細胞中NEDD4蛋白相對表達量分別為1.00±0.03、1.06±0.02、0.40 ±0.01，PTEN蛋白相對表達量分別為 1.01±0.06、1.49±0.10、3.10±0.16，p73蛋白相對表達量分別為1.00±0.03、1.20±0.03、1.86±0.04，與陰性對照組相比，實驗組NEDD4蛋白及其下游靶蛋白PTEN和p73表達均增加(P均<0.001)。

3 討論

膀胱癌是我國高發的泌尿系統惡性腫瘤，其發病率占泌尿系統惡性腫瘤之首。病理上膀胱癌分為肌層浸潤性和非肌層浸潤性兩種，前者常采用的治療方案為膀胱切除術，后者多采用經尿道膀胱腫瘤電切術，但膀胱癌術后的轉移和復發率仍較高。因此，有必要深入了解膀胱癌發生轉移、侵襲的分子機制。腫瘤的發生是一種多基因、多步驟、多因素的慢性復雜過程。研究[14]認為，腫瘤的發生是由于細胞內蛋白表達發生紊亂，促癌基因表達增加，而抑癌基因表達下調或失活。腫瘤細胞最主要的特點就是增殖不受限制，最終侵襲其他細胞或組織。

NEDD4是一種重要的E3泛素連接酶，在結構上，NEDD4由具有催化功能的C-端HECT結構域和具有底物識別功能的N-端結構域(包括一個C2結構域和一系列WW結構域)組成。近年研究發現，NEDD4在腫瘤的發生發展中發揮重要功能。NEDD4參與耐藥鼻咽癌細胞的上皮-間充質轉化[15]。研究表明,NEDD4在包括膀胱癌在內的多種腫瘤組織中表達上調，然而其表達與腫瘤大小、分級及分期并無關聯。NEDD4主要在內質網、溶酶體和蛋白酶體中以泛素依賴性方式介導蛋白質降解，發揮生物學功能[16]。Wang等[5]研究發現，NEDD4能直接靶向泛素化降解PTEN，并以依賴沉默PTEN方式抑制異種移植瘤的生長。此外，NEDD還能通過靶向泛素化降解LATS1而抑制Hippo信號通路[7]。以上研究表明NEDD4在多數腫瘤中發揮腫瘤促進功能，因此，靶向沉默NEDD4可能是治療人類癌癥的有效策略。

基于以上研究，我們推測NEDD4通過調控PTEN和p73表達參與膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲。本實驗結果表明，PTEN和p73蛋白表達隨NEDD4的沉默而上調，且能下調膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。此與我們之前的推測相符。

Ye等[9]提出，NEDD4是調控諸多腫瘤發生與惡性進展的信號通路，是一個潛在的腫瘤治療靶點。本研究證實，沉默NEDD4通過上調其下游靶分子PTEN和p73蛋白而抑制膀胱癌細胞增殖、遷移和侵襲能力。

綜上所述，NEDD4基因沉默能抑制膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲。