體外受精－胚胎移植中移植不同培育時間、單雙胚胎的不孕癥患者受孕及妊娠結局觀察

李翔，曾莠蔓，羅宇迪，張炬光，羅博文，何娟，賈俊龍

(1玉林市婦幼保健院，廣西玉林，537000;2中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四〇醫院)

不孕不育是與工作壓力和生活環境等因素相關的疾病。近年，不孕不育發病率逐漸升高，且發病年齡趨于年輕化。迄今為止，體外受精－胚胎移植技術(IVF－ET)是治療不孕不育最有效的醫療手段，但是使雙胎妊娠及多胎妊娠等不良妊娠結局發生的概率增加，產婦及新生兒并發癥發病率升高［1]。因此，選擇移植胚胎的發育天數和減少胚胎移植的數量，在不影響患者受孕率的同時降低多胎妊娠的發生率受到越來越多的關注。部分研究者認為延長體外培養天數至囊胚移植，其受孕率優于卵裂期胚胎［2]，但是有研究者認為卵裂期胚胎移植也可以達到良好的妊娠效果［3]。對于移植胚胎數量的選擇，研究者認為采用單胚胎移植可以有效減少多胎妊娠的發生［4，5]。本研究通過分析移植胚胎的發育天數和數量對妊娠結局的影響，以期為臨床應用提供有效的參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年7月～2018年2月間于本院生殖醫學中心行常規體外受精/卵胞漿內單精子注射—胚胎移植(IVF/ICSI－ET)助孕治療的不孕不育患者1 719例為研究對象。納入標準：年齡＜38歲;無遺傳性及家族性病史;不孕原因為盆腔輸卵管因素和男方因素。排除標準：存在習慣性流產史;存在子宮畸形、合并子宮肌瘤、子宮腺肌癥;卵巢功能減退者。本研究經本院倫理委員會批準同意，納入者均簽署知情同意書。

1.2 IVF/ICSI－ ET方法 ①促排卵：納入者均行黃體期長方案或卵泡期長方案，B超檢測卵泡發育情況，當主導卵泡2個＞18 mm或3個＞18 mm，雌二醇＞150 mg/卵時，肌肉注射人絨毛膜促性腺激素(HCG)10 000 IU，注射36 h經陰道超聲采卵。②授精及胚胎培養：將取卵+受精日記為第0日(D0)、胚胎培養第1天記為D1。D3挑選1～2個優質胚胎移植或冷凍、剩余3級以上的胚胎轉至預先平衡好的囊胚培養液微滴中進行培養。D5、D6分別觀察囊胚形成情況及形態。③胚胎質量觀察：D3觀察胚胎發育情況，胚胎評級1、2級胚胎為優質胚胎。D5、D6按照Gardner評分系統對囊胚進行質量評級，可利用胚胎定義為3期以上，內細胞團及滋養層細胞不同時為C級。④胚胎移植新鮮胚胎移植移植D3期卵裂胚和D5期囊胚，凍融胚胎移植移植D3期卵裂胚、D5期和D6期囊胚。新鮮胚胎移植選擇1～2枚3級以上D3期胚胎進行移植或者冷凍;選取1～2枚D5可用囊胚以上的囊胚新鮮移植或者冷凍，D6形成囊胚只冷凍不進行新鮮移植。胚胎冷凍和解凍均采用玻璃化快速冷凍解凍方法，胚胎冷凍液和胚胎解凍液購于日本加藤(10101、10102)。單胚胎移植可進行新鮮胚胎移植(D5囊胚、D3胚胎)、凍融胚胎移植(D3胚胎、D5胚胎、D6胚胎)移植，雙胚胎移植可進行新鮮胚胎移植(D5囊胚、D3胚胎)、凍融胚胎移植(D3兩枚胚胎、D5兩枚胚胎、D6兩枚胚胎)移植。新鮮胚胎移植胚胎移植標準：獲卵數較多且有卵巢過度刺激綜合征(OHSS)傾向不移植。年齡＜38歲，獲卵數不多且無卵巢過度刺激綜合征(OHSS)傾向，移植1～2枚D3胚胎或者D5囊胚。凍融胚胎移植優先移植優質囊胚，然后D3優質胚胎。

1.3 受孕及妊娠結局觀察 移植后觀察各組妊娠結局(生化妊娠、臨床妊娠)：移植后14、18檢測外周血B－hCG陽性［5]可判定為生化妊娠。臨床妊娠：移植后第35天行腹部B超觀察子宮腔內孕囊數目和心管搏動情況，測算臨床受孕率、種植率、異位妊娠率、流產率、多胎率。臨床受孕率=臨床妊娠周期數/移植胚胎周期數×100%，種植率=B超下見到孕囊數/移植胚胎數×100%，異位妊娠率=異位妊娠周期數/臨床妊娠周期數×100%，流產率=流產周期數/臨床妊娠周期數×100%，多胎率=多胎妊娠周期/臨床妊娠周期數×100%。

1.4 統計學方法 采用SPASS24.0統計軟件進行處理。多組計量資料用±s表示，組間比較采用單因素方差分析(One－way ANOVA)，兩兩比較采用SNK－q檢驗;定性資料中 %比較采用χ2檢驗，若有一個格子的理論頻數＜5則用 Fisher’s確切概率法，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

1 179例患者中，單胚胎移植的新鮮胚胎移植中D3胚胎者66例、D5囊胚者29例，凍融胚胎移植移植中D3胚胎者56例、D5胚胎者23例、D6胚胎者40例。雙胚胎移植的新鮮胚胎移植中D3胚胎者747例、D5囊胚者31例，凍融胚胎移植移植中D3胚胎者561例、D5胚胎者121例、D6胚胎者45例。

新鮮胚胎移植D3單胚胎移植者的年齡(33.03±4.00)歲，BMI(22.59 ± 3.13)Kg/m2，不孕(5.15±3.95)年，既往胚胎移植(1.23 ±0.46)周期，基礎FSH(5.91 ± 1.61)IU/L、Gn 總量 (2 310.61 ±713.34)IU、Gn 使用(10.70 ±2.36)d、獲卵數(9.73±4.03)個、內膜厚度(10.36 ±2.10)mm、臨床受孕率25.76%(17/66)、種植率 25.76%(17/66)、流產率29.41%(5/17)、異位妊娠率 5.88%(1/17)、多胎率0;新鮮胚胎移植D5單胚胎移植者的年齡(31.41 ±4.32)歲，BMI(22.43 ±3.12)Kg/m2，不孕(3.69 ±2.52)年，既往胚胎移植(1.17 ±0.54)周期，基礎 FSH(5.30 ±1.80)IU/L、Gn 總量(2 337.93 ±399.14)IU、Gn 使用(10.90 ±2.70)d、獲卵數(10.10 ±2.60)個、內膜厚度(10.33 ±1.96)mm、臨床受孕率 51.7%(15/29)、種植率 51.7%(15/29)、流產率 6.67%(1/15)、異位妊娠率 0、多胎率0。與新鮮胚胎移植D3單胚胎移植者比較，新鮮胚胎移植D5單胚胎移植者臨床受孕率、種植率升高，流產率降低(P均＜0.05)。凍融胚胎移植D3單胚胎移植者的年齡(32.68 ±3.87)歲，BMI(22.35±2.80)Kg/m2，不孕(3.79 ±2.15)年，既往胚胎移植(1.85 ±0.49)周期，基礎 FSH(5.64 ±2.50)IU/L、內膜厚度()mm、臨床受孕率21.43%(12/58)、種植率21.43%(12/58)、流產率 16.67%(2/12)、異位妊娠率0、多胎率0;凍融胚胎移植D5單胚胎移植者的年齡(32.09 ± 4.59)歲，BMI(21.66 ± 5.55)Kg/m2，不孕(4.13 ±1.91)年，既往胚胎移植(1.83±0.58)周期，基礎FSH(6.06 ±2.81)IU/L、內膜厚度(9.65+1.62)mm、臨床受孕率60.08%(32/53)、種植率54.24%(32/59)、流產率0、異位妊娠率0、多胎率10.08%(3/30);凍融胚胎移植D6單胚胎移植者的年齡(33.25 ±3.33)歲，BMI(22.48 ±2.55)kg/m2，不孕(4.68 ±2.68)年，既往胚胎移植(1.95±0.50)周期，基礎FSH(5.81 ±1.59)IU/L、內膜厚度(9.98 ±2.02)mm、臨床受孕率30.00%(12/40)、種植率 30.00%(12/40)、流產率 25.00%(3/12)、異位妊娠率0、多胎率0。與凍融胚胎移植D3、D6單胚胎移植者比較，凍融胚胎移植D5單胚胎移植者臨床受孕率、種植率升高(P均＜0.05)。

新鮮胚胎移植D3雙胚胎移植者的年齡(31.35±3.80)歲，BMI(21.85 ± 3.03)Kg/m2，不孕(4.45±3.06)年，既往胚胎移植(1.15 ±0.45)周期，基礎FSH(5.58 ±1.41)IU/L、Gn 總量 (2267.49 ±764.64)IU、Gn 使用(11.27 ± 2.15)d、獲卵數(10.73 ±4.42)個、內膜厚度(10.15 ±1.75)mm、臨床受孕率 56.49%(422/747)、種植率 38.22%(571/1494)、流產率 2.09%(46/422)、異位妊娠率2.84%(12/422)、多胎率 34.36%(145/422);新鮮胚胎移植D5雙胚胎移植者的年齡(31.90±3.72)歲，BMI(22.37 ± 3.06)Kg/m2，不孕(4.35 ± 3.32)年，既往胚胎移植(1.23±0.56)周期，基礎 FSH(5.31 ±1.86)IU/L、Gn 總量 (2174.73 ±774.79)IU、Gn 使用(11.13 ±2.20)d、獲卵數(10.48 ±2.93)個、內膜厚度(10.04 ±1.69)mm、臨床受孕率74.19%(23/31)、種植率 59.68%(37/62)、流產率4.35%(1/23)、異位妊娠率 0、多胎率 30.43%(7/23)。與新鮮胚胎移植D3雙胚胎移植者比較，新鮮胚胎移植D5雙胚胎移植者種植率、受孕率升高(P均 ＜0.05)。

凍融胚胎移植D3雙胚胎移植者的年齡(31.93±3.70)歲，BMI(21.85 ± 3.06)Kg/m2，不孕(3.98±2.04)年，既往胚胎移植(2.13 ±0.50)周期，基礎FSH(5.80 ±2.27)IU/L、內膜厚度(9.48 ± 1.49)mm、臨床受孕率47.59%(267/561、種植率 32.80%(368/1122)、流產率16.48%(44/267)、異位妊娠率6.35%(17/267)、多胎率 36.33%(97/267);凍融胚胎移植D5雙胚胎移植者的年齡(31.63±3.25)歲，BMI(22.58 ±3.22)Kg/m2，不孕(3.92 ±1.92)年，既往胚胎移植(2.16 ±0.56)周期，基礎 FSH(5.95±2.08)IU/L、內膜厚度(9.51+1.50)mm、臨床受孕率 76.03%(92/121)、種植率 59.92%(145/242)、流產率 4.35%(4/92)、異位妊娠率 3.26%(3/92)、多胎率55.43%(51/96);凍融胚胎移植D6雙胚胎移植者的年齡(31.20 ±4.12)歲，BMI(22.59±2.85)kg/m2，不孕(3.81 ±2.46)年，既往胚胎移植(2.20 ±0.73)周期，基礎 FSH(5.53 ±1.32)IU/L、內膜厚度(9.56 ±1.36)mm、臨床受孕率 51.11%(23/45)、種植率 41.11%(37/90)、流產率 0、異位妊娠率0、多胎率8.69%(2/23)。與凍融胚胎移植D3、D6雙胚胎移植者比較，凍融胚胎移植D5雙胚胎移植者臨床受孕率、種植率、多胎率升高(P均＜0.05);與凍融胚胎移植D3雙胚胎移植者比較，凍融胚胎移植D6雙胚胎移植者臨床受孕率、種植率升高，多胎率、流產率降低(P均＜0.05);與凍融胚胎移植D3雙胚胎移植者比較，凍融胚胎移植D5雙胚胎移植者異位妊娠率升高(P＜0.05)。

3 討論

近年來，隨著輔助生殖技術的發展和胚胎培養條件的成熟，IVF中心傾向于對患者胚胎行囊胚培養，在胚胎發育到第5或6天移植1～2枚優質囊胚［2，4]。但是，囊胚培養延長了胚胎在體外暴露的時間，胚胎質量、卵母細胞質量及培養環境等均可影響囊胚形成，可能會造成無胚胎可用的情況［6]。因此，選擇在受精后第3天移植1～2枚8細胞以上的優質胚胎，可以減少取消移植周期的風險。有研究報道，卵裂期胚胎移植期受孕率和種植率與囊胚移植無明顯差異［3]。本研究中，我們新鮮胚胎移植選擇移植1～2枚第3天優質期卵裂期胚胎或者選擇移植第5天1～2枚可用囊胚;凍融胚胎移植優先選擇D5囊胚移植，D6和D3優先選擇優質胚胎移植。結果顯示，在新鮮胚胎移植和凍融胚胎移植中，囊胚移植其受孕率和種植率均高于卵裂期胚胎移植，其中D5囊胚優于D6囊胚，這與國內外多項研究［4，7]結果一致。可能的原因：①在正常生理狀態下，4～8細胞的卵裂期胚胎處在輸卵管中，而囊胚期胚胎才遷移至子宮內著床，所以移植囊胚符合內膜容受性［8];②發育速度較快的胚胎其存活能力更高，胚胎的發育速度較快其發育潛能可能更高，所以D5囊胚受孕率更高［9];③發育潛能較差的胚胎可能停滯在基因組激活的卵裂期階段，體外繼續培養后能夠形成的囊胚，其染色體異常的比例更低，D3卵裂胚可能部分停滯發育［10];同時，本研究結果顯示，移植2枚D3卵裂期胚胎可以獲得高達53%的受孕率和較高種植率，但是存在較高的多胎率。因此，對于獲卵數較多的患者胚胎進行囊胚培養，優先選擇D5囊胚進行移植，對于獲卵數較少的患者可以選擇2枚D3優質卵裂期胚胎移植，獲得較好的臨床效果。

早期IVF－ET通常選擇移植2～3枚優質胚胎，以便增加患者受孕率。但是，這種片面追求受孕率的提高，已不適應當前輔助生殖技術發展的需要。有研究報道，多胚胎移植顯著增加多胎妊娠發生的概率，而多胎妊娠增加了產婦高血壓、不足月產和早產的概率，低體重兒和腦癱患兒的概率也隨之增加，降低多胎妊娠的最佳手段是單胚胎移植，可明顯降低雙胎率的同時獲得更好的產科結局［11，12]。黃志輝等［13]對D3選擇性單胚胎移植的圍產結局分析發現，D3雙胎移植受孕率顯著高于單胎移植，但是兩組間種植率無差異，單胎移植明顯降低多胎妊娠的發生，獲得更好的妊娠結局。本研究通過對D3卵裂期單胚胎和多胚胎移植進行對比發現，D3雙胚胎移植受孕率可達47%～54%，單胚胎移植受孕率僅為21%～26%，但是D3雙胚胎移植多胎率高達30%以上，單胚胎移植未發現多胎妊娠?？赡艿脑蛴校郝蚜哑谂咛仍谫|量可能直接決定其發育潛能，從而影響胚胎移植后的臨床結局［14];胚胎發育到4～8細胞期存在明顯阻滯現象，雙胚胎移植增加了突破阻滯的機率。

單囊胚移植臨床受孕率和活產率較高，且多胎率、異位妊娠率及卵巢過度刺激發生率較低，但是選擇不同發育階段(D5和D6)和數量的囊胚移植，臨床妊娠結局存在差異。Yang等［15]研究發現，D5囊胚臨床受孕率和著床率高于D6囊胚，但是D5和D6優質囊胚臨床結局差異無統計學意義。陳清汾等研究發現D5囊胚受孕率高于D6囊胚，滋養層評分高的D5囊胚可以提高受孕率，降低流產率［16]。Gardner等［4]研究發現單囊胚與雙囊胚移植的臨床受孕率分別為60.9%、76.0%，兩組比較差異無統計學意義，但是單囊胚移植患者的多胎受孕率為0，顯著低于雙囊胚移植組的雙胎率47.4%。Henman等［17]通過對單囊胚與雙囊胚移植進行比較，發現兩組間受孕率分別為 65.3%、64.2%，雙胎率為7.0%、34.0%。本研究發現D5期囊胚移植受孕率和種植率顯著高于D6期囊胚移植，存在統計學意義;雙囊胚移植受孕率顯著高于單囊胚移植，但是雙囊胚移植多胎率(30% ～55%)顯著高于單囊胚(0～10%)(缺乏新鮮胚胎移植D6囊胚移植的數據);D5單囊胚移植受孕率可以達到(51% ～56%)，多胎率僅為10%。因此，選擇D5單囊胚移植，可以穩定受孕率的同時，降低多胎率的發生。

玻璃化冷凍雖然是可行的技術，但是冷凍因素導致透明帶變硬，將會影響胚胎的孵化和著床［18]。文曉鳳等研究報道，刺激周期給予全胚冷凍后行解凍移植能夠增加患者的臨床受孕率及種植率［19]。本研究發現，新鮮胚胎移植和凍融胚胎移植選擇D5單囊胚移植，均可以獲得良好的臨床效果。

綜上所述，無論新鮮胚胎移植或凍融胚胎移植，IVF－ET中胚胎發育D5囊胚移植后妊娠結局最佳，可以獲得穩定受孕率，減少多胎妊娠的分險。對于獲卵數較少的患者可以選擇2枚D3優質卵裂期胚胎移植，也可以獲得較好的臨床效果。