大豆胰蛋白酶抑制因子的危害及其檢測研究進展

■王 耀 吳佳蓓 王珍玉 李燕虹， 鄧瑞廣 胡驍飛*

（1.河南科技大學 食品與生物工程學院 食品加工與安全國家級實驗教學示范中心食品原料河南省工程技術研究中心，河南洛陽471023；2.河南省農業科學院農業部動物免疫學重點實驗室河南省動物免疫學重點實驗室，河南鄭州450002）

大豆含有豐富的蛋白質、均衡的必須氨基酸和營養元素，屬于植物蛋白中為數不多的優質蛋白資源，然而大豆中也含有多種抗營養因子，包括胰蛋白酶抑制因子、凝集素、抗原蛋白、異黃酮、單寧、和生物堿等[1]，它們對動物消化、吸收營養物質造成不良影響，限制了大豆在食品工業及飼料工業中的利用效率。胰蛋白酶抑制因子在抗營養因子中含量較高，是主要的一類抗營養因子，因此它在飼料原料中的含量是評價大豆飼料原料質量優劣的重要指標。介于大豆在現實生活中在食品及飼料工業中的廣泛應用，研究大豆胰蛋白酶抑制因子的性質、危害機理及其檢測方法就顯得尤為必要。本文對大豆胰蛋白酶抑制因子的危害及其檢測方法研究進行綜述，以期為食品工業及飼料工業中大豆胰蛋白酶抑制因子的高效監測提供依據，為大豆胰蛋白酶抑制因子檢測方法的深入研究與應用提供一定的參考。

1 大豆胰蛋白酶抑制因子概述

大豆胰蛋白酶抑制因子（Soybean trypisin inhibitor，STI）主要可以分為Kunitz型、Bowman-Birk型、Kazal 型、PotatoⅠ型及PotatoⅡ型等，含量相對較高的是Kunitz 型胰蛋白酶抑制因子（Kunitz trypisin inhibitor，KTI）和Bowman-Birk 型胰蛋白酶抑制因子（Bowman-Birk inhibitor，BBI）[2]，在大豆中的含量分別約為1.4%和0.6%[3]。KTI 由Kunitz 首次從大豆中分離并結晶而命名，相對分子質量為20 000～25 000，該抑制因子具有一個活性中心，可結合一分子的胰蛋白酶[4]。BBI由Bowman首先從大豆中分離并由Birk鑒定而得名[5]，相對分子量為6 000～10 000，該抑制因子有兩個活性中心，可分別與胰蛋白酶和糜蛋白酶結合，故又被稱為雙頭抑制因子[6]。

大豆胰蛋白酶抑制因子的抗營養機理主要體現在一方面能結合動物消化系統中的胰蛋白酶，生成有機復合物，導致胰蛋白酶不能作用于蛋白質，使蛋白質不能很好的被分解消化；另一方面它引起機體內蛋白質內源性消耗，最終會致使胰腺及其他組織器官的增生和肥大[7]。

2 大豆胰蛋白酶抑制因子的危害

2.1 對蛋白質消化率和利用率的影響

大豆胰蛋白酶抑制因子會與小腸液中的胰蛋白酶、糜蛋白酶結合，生成無活性的復合物，使酶的活性喪失，導致蛋白質消化利用率下降，同時引起動物體內蛋白質的內源性消耗[8]。王桂芹等[9]研究發現，將魚食中的抗胰蛋白酶抑制因子除去后，鯉魚體重、蛋白酶活力、RNA/DNA 和血清IGF-I 顯著高于對照組，說明大豆抗胰蛋白酶抑制因子會導致魚類的蛋白酶活性下降，使蛋白質和其他營養物質的利用率下降。張建云等[10]通過喂食幼兔不同日糧一定時間后，觀察記錄幼兔對蛋白質和其他營養物質的吸收利用情況，當幼兔食用的飼料中含有大豆成分時，氮的平衡和養分消化率會受到影響，而喂食幼兔的飼料中不含大豆成分時，飼料利用率不會受到影響。

2.2 對胰腺組織的影響

胰腺是重要的消化器官，能夠保證機體對于營養物質的消化吸收，同時也擔負著調節消化系統中各生理過程的功能。Huisman 等[11]研究發現長期喂食大鼠生大豆，其胰腺分泌能力增強，可引起胰腺細胞腫大，細胞質會含有較多的酶原顆粒。韓玲玲[12]系統研究了大豆胰蛋白酶抑制因子對胰腺的損傷，研究發現胰蛋白酶抑制因子能夠增加自由基，導致氧化應激的產生，使胰腺氧化損傷，進而產生胰腺腫大，影響胰腺分泌功能。李淑君[13]以胰腺線粒體為研究對象，發現大豆胰蛋白酶抑制因子能夠誘導線粒體氧化應激，使線粒體出現腫脹空泡化及細胞核溶解等不可逆損傷。

2.3 對動物生長的影響

胰蛋白酶與抑制因子的親和力比與胰蛋白酶底物的親和力高，結合速度也更快，且結合形成的復合物具有緊密連接的化學鍵，該化學鍵不容易被破壞，同時也意味著不容易被機體消化吸收，所以只能通過糞便的形式排出體外，由此造成了大量氨基酸的流失，最終導致出現生長緩慢的現象[14-15]。大豆胰蛋白酶抑制因子對動物生長有顯著影響，但是根據動物的種類不同，影響程度的大小和胰蛋白酶抑制因子引起異常變化的部位也不盡相同。Herkelm 等[16]研究表明，胰蛋白酶抑制因子對仔豬生長具有明顯的抑制效果，在不同生長階段的動物，對大豆胰蛋白酶抑制因子的反應強度會因年齡、種類和體重等因素的影響而不同。此外，有試驗表明大豆胰蛋白酶抑制因子對機體生長抑制的效果強弱與其在日糧中的含量相關，隨著含量不斷增加，仔豬生長速度也會隨之下降[17]。

3 大豆胰蛋白酶抑制因子的檢測方法

近年來，針對大豆胰蛋白酶抑制因子的檢測方法研究逐漸展開，已成為相關學者們的研究熱點方向。目前，對于大豆胰蛋白酶抑制因子較為成熟的檢測方法包括脲酶檢測法、酶化學檢測法和免疫檢測法。

3.1 脲酶檢測法

大豆中胰蛋白酶抑制因子與脲酶有相似的含量和活性，當大豆胰蛋白酶抑制因子進行相關處理時，脲酶的活性也會隨之受到相應的損害，其變性失活的程度與胰蛋白酶抑制因子相似，由于大豆制品中的脲酶含量較易檢出，故可通過脲酶的檢測間接檢測胰蛋白酶抑制因子[18]。目前脲酶的測定方法主要有pH 值增值法和滴定法。pH 增值法是利用脲酶將尿素水解產生氨氣，從而引起反應體系pH 值變化，來計算脲酶的活性[19]。滴定法是利用過量的鹽酸中和尿素被脲酶分解產生的氨，再用氫氧化鈉標準溶液回滴[20]。但因為脲酶易于分解，通過不同的溫度處理方法可以部分或者全部使其鈍化失活，當大豆及其相關產品受熱程度過高時該方法就不再適用。此外，脲酶的活性還受水分、壓力的影響，所以該方法的適用性較差。

3.2 酶化學檢測法

Kakade 等[21]最早提出酶化學法來測定大豆制品中的大豆胰蛋白酶抑制因子，是一種比較經典的方法。該方法的原理是以有色的苯甲酰-DL-精氨酸-對硝基?；桨罚―L-BAPA）作為胰蛋白酶底物，在標準酶溶液中加入不同量抑制因子，測定活性減少的程度，然后繪制出抑制曲線，即可通過比色并根據曲線得到待測樣品所含抑制因子的量。但該方法對于大豆胰蛋白酶抑制因子的檢測靈敏度相對較低，對于加熱過度樣品的檢測結果變異較大，而且樣品提取液中除胰蛋白酶抑制因子之外的其他成分，如植酸、單寧、脂肪酸等物質，均會對胰蛋白酶活性產生抑制，所以會對真實結果產生影響[22]。

3.3 免疫檢測法

酶聯免疫吸附試驗（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是一種經典的免疫檢測方法，在大豆抗營養因子檢測中應用較為廣泛[23-24]。該方法是在抗原抗體特異性結合的基礎上，利用酶的高效催化特性，將試驗反應結果放大，從而使結果更容易被定性和定量，該方法擁有酶催化反應的敏感性以及抗原抗體反應的特異性，因此具有較高的靈敏度[25]。張國龍等[26]利用兔源多克隆抗體建立了3 種檢測KTI 的ELISA 方法（酶標抗原直接競爭、酶標抗體直接競爭、間接抑制法），3種方法的檢測限均能夠達到20 ng/ml，可用于大豆和大豆產品中KTI 的定量檢測。邢春芳等[27]同樣利用大豆胰蛋白酶抑制因子多克隆抗體，建立了間接競爭ELISA 方法，能夠代替酶化學檢測法用于豆粕及豆制品中胰蛋白酶抑制因子的檢測。Xu 等[28]通過制備KTI 單克隆抗體，建立了KTI 的夾心ELISA 檢測方法，該方法具有較高的靈敏度，最低檢測限為0.148 1 ng/ml。ELISA 方法具有成本低廉、簡便快速、敏感特異且不需大型儀器設備等優點，對于樣品純度要求不高，非常適合批量樣品的快速篩查[29]。

免疫層析試紙檢測方法是在ELISA 方法基礎之上發展起來的一種免疫檢測方法，該方法在抗原抗體特異性反應的基礎上，利用與抗體偶聯的有色或發光納米材料的光學特性，可通過裸眼或借助簡單儀器對檢測結果進行直觀判定，相對于ELISA方法更為快速，但其通常用于定性與半定量檢測，該方法目前已在大豆抗營養因子檢測方面得到了應用[30-31]。Xu等[28]同樣利用單克隆抗體，通過夾心模式建立了KTI免疫層析試紙檢測方法，試驗表明該方法檢測牛奶樣品中KTI的檢測限為5 ng/ml，并且能夠用于大豆樣品中KTI的半定量分析。

4 小結與展望

大豆胰蛋白酶抑制因子嚴重影響了大豆在食品工業及飼料工業中的利用率，其檢測研究已成為食品及飼料安全監控的重要技術支撐。酶化學檢測法雖然是檢測大豆胰蛋白酶抑制因子的經典方法，但其靈敏度低、測定結果不穩定，且檢測結果不能區分大豆胰蛋白酶抑制因子的種類。近年來，利用特異性抗體建立起來的免疫檢測方法在準確性、特異性、穩定性、適用范圍以及檢測效率、費用等方面都具有一定的優勢，能夠用于特定大豆胰蛋白酶抑制因子的檢測，已成為快速檢測方法研究的主要趨勢，具有良好的發展前景。免疫檢測方法研究的關鍵在于抗體的制備，目前所開發的胰蛋白酶抑制因子免疫檢測方法多數利用的是多克隆抗體，而單克隆抗體的親和力和特異性都優于多克隆抗體，所以大豆胰蛋白酶抑制因子單克隆抗體的研制將是今后免疫檢測方法研究的一個關鍵內容。此外，目前免疫檢測研究多集中在KTI 的檢測方面，而針對其他類型的大豆胰蛋白酶抑制因子的檢測研究仍相對缺乏，因此建立全面、特異、高效的免疫檢測方法來快速監測大豆及其制品中各類胰蛋白酶抑制因子含量顯得尤為必要。