轉化生長因子-β在糖尿病微血管病變發病中作用的機制研究進展

賈哲，楊文文，楊雅昊，秦勝花

(1桂林醫學院，廣西桂林 541001；2桂林市人民醫院)

轉化生長因子-β(TGF-β)是由兩條12.5 kda多肽鏈以二硫鍵結合組成的二聚體[1]，共有5種亞型，開始在機體細胞中以無活性形式存在。TGF-β超家族包括配體、受體、信號轉導分子等，TGF-β和BMPs是兩個較為主要的配體。目前已知的TGF-β超家族受體有三種，Ⅰ型和Ⅱ型受體因富含絲氨酸/蘇氨酸激酶的胞內區而直接參與信號的轉導，Ⅲ型受體因不含上述激酶活性區而通過調節TGF-β與TβR-Ⅱ的結合而間接參與信號的傳導。Smad依賴和非Smad依賴信號通路是TGF-β超家族所涉及的兩條重要信號傳導通路，Smads可將信號由胞外傳導至細胞核，其為TGF-β下游的至關重要的反應蛋白[2]；Smads有Smad1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad5、Smad6、Smad7、Smad8，按照功能可分為受體調節Smad(R-Smad)、共同介質Smad(co-Smad)和抑制Smad(I-Smad)[3]。糖尿病是以機體長期處于高血糖狀態為特征的全身慢性代謝性疾病。糖尿病本身并不可怕，可怕的是糖尿病病變。糖尿病病變包括糖尿病微血管病變[糖尿病腎病(DN)、糖尿病視網膜病變(DR)、糖尿病足(DF)]、大血管病變、神經病變。糖尿病微血管病變可能與機體長期高糖狀態所造成的細胞缺氧、氧化應激、血管內皮損傷有關。而TGF-β作為一種具有多項功能及調節作用的因子，廣泛參與多種組織細胞的氧化應激、免疫、新生血管的形成、纖維化修復過程。因此，綜述轉化生長因子-β在糖尿病微血管病變發病(DN、DR、DF)中的作用機制 ，將會為糖尿病微血管病變的防治提供更多分子靶點，為糖尿病微血管病變的新藥研究提供更新思路，進而減緩糖尿病患者的經濟壓力，改善糖尿病患者的生存質量。

1 TGF-β在DN發病中作用機制

數據顯示，我國已成為糖尿病大國，而DN已成為糖尿病進展過程中較常見并治療困難的糖尿病微血管病變之一。在西方國家，DN已成為慢性腎臟病及終末期腎病的主要原因。DN發病機制復雜，并不十分清楚，資料顯示主要有腎臟血管血流動力學改變、細胞因子、氧化應激、糖脂代謝異常、自噬[4]。DN早期腎小球改變的特點是系膜細胞肥大、系膜基質增生、腎小球基底膜增厚，最終足突融合消失[5]。肥大的系膜細胞可分泌膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白等，這些蛋白統稱細胞外系膜蛋白，被分泌并沉積在腎小球細胞外導致腎小球硬化、纖維化。腎小球硬化及纖維化是DN晚期主要病理改變。

TGF-β在腎小球、腎小管以及間質中都有廣泛的分布。相關研究證明，TGF-β1已被公認為是具有致纖維化的細胞因子。無論是在纖維化的心肌、肺臟、肝臟及腎臟，TGF-β1均呈現為高表達，同樣抑制TGF-β1的表達，上述纖維化過程可以達到逆轉[6]。縱觀各種器官纖維化過程，細胞外基質蛋白(ECM)的沉著聚集起著重要作用。TGF-β1可通過促進ECM的生成并抑制其降解而使ECM過度沉積至纖維化。TGF-β1可從轉錄水平直接誘導膠原Ⅰ、纖連蛋白等ECM的合成，使用TGF-β1的中和抗體、修飾素(Decorin)或反義寡核苷酸能減少如細胞外基質蛋白、Ⅳ型膠原蛋白基因的表達[7,8]。TGF-β1也可通過影響腎臟固有細胞包括腎小球上皮細胞及內皮細胞損傷間接致腎纖維化和DN發生和惡化。Meng等[9]利用RNA測序技術，腎小管上皮細胞被TGF-β1刺激后，其基因轉錄差異表達。相關研究報道，在DN早期，腎小球濾過率增高，腎小球毛細血管內壓及濾過膜通透性增加，牽張系膜，進而損傷血管內皮細胞，加重系膜擴張，一方面通過代償機制促進系膜細胞肥大、系膜基質增生、腎小球基底膜增厚，ECM沉積；另一方面系膜在受到牽張作用后，TGF-β1的表達顯著升高，與此同時，上皮細胞有關其凋亡的指數也升高，進而炎性浸潤進一步蔓延發展[10]。通過參與腎臟細胞的增殖、分化，TGF-β可參與炎癥和免疫反應，其中它可以使炎癥因子表達而促進炎癥反應，而免疫反應得到抑制[11]。TGF-β1本身對DN的影響外，TGF-β1/Smad信號通路在DN發展過程中也具有重要作用；TGF-β1/Smad信號通路傳導的基本構成已在本文開篇進行了敘述。在腎小管上皮細胞中表達一種單向跨膜蛋白質Klotho，其可直接結合TGF-βIIR阻斷TGF-β信號的啟動，進而抑制腎纖維化[12]。TGF-β1活性抑制劑LY2382770、R-268712、Fresolimumad在梗阻性腎病大鼠模型及DN患者中取得一定的療效[13,14]。Smad3是TGF-β下游調節蛋白，其在DN中廣泛參與。上述結論在DN小鼠模型中得到證實[15]。Smad7作為I-Smad蛋白，其可通過競爭性地與TβRⅠ結合，反饋性抑制Smad2、3磷酸化并且抑制白介素-1β和腫瘤壞死因子α誘導的NF-κB炎癥信號通路從而干預或阻止腎臟纖維化過程[16]。另外相關實驗表明，TGF-β信號通路還可以通過與JNK 信號通路之間交互作用調節DN腎小球硬化[17]。

2 TGF-β在DR中作用機制

DR主要病理改變是視網膜微血管損害，病因為長期的糖尿病史。在青、中年致盲性疾病中，DR位居第一位。DR可分為Ⅰ～Ⅵ 6期，臨床又以是否發生新生血管為標志，將其分為非增生性糖尿病視網膜病變(NPDR)和增生性糖尿病視網膜病變(PDR)兩大類，其中Ⅰ～Ⅲ期屬于NPDR，Ⅳ～Ⅵ期屬于PDR。PDR又可分為兩種類型，其中一種以視網膜新生血管為主，也稱紅色花邊型PDR，另一種是以纖維血管膜或纖維膜為主，也稱膠質增生型PDR。目前，DR的發病可能與炎癥反應及纖維化、組織缺血缺氧、細胞增生與凋亡失衡有關。TGFβ1是具有多功能、雙向調控的細胞因子，它在細胞增殖、炎癥反應、損傷修復及纖維化中均有參與[18]。羅大衛等通過測定糖尿病、NPDR、PDR以及健康非糖尿病者的血清TGF-β水平，發現糖尿病患者TGF-β水平顯著高于健康者，PDR患者血清TGF-β水平顯著高于NPDR、NDR患者[19]。而王勁松等[20]也證實，DR患者血清TGF-β水平明顯高于NPDR患者。單俊杰[21]的研究證實，TGF2β1水平隨DR病情進展而升高。

TGF-β廣泛存在于眼組織中，包括結膜、睫狀體、晶狀體上皮、視網膜血管等。眼組織中TGF-β大多由視網膜色素上皮細胞(RPE)產生，且以TGF-β2為主。研究證明，無論在NPDR期還是在PDR均有重要的參與。血-視網膜屏障是視網膜內循環過程中的最重要屏障，而視網膜毛細血管是視網膜血-視網膜屏障的重要組成部分。內皮細胞、周細胞、基底膜共同組成了視網膜毛細血管。NPDR期病理生理基礎主要有選擇性視網膜微血管周細胞的數量上減少和基底膜累積。Senstein等證實，周細胞分泌的TGF-β可抑制內皮細胞增殖。而在DR早期周細胞的選擇性丟失造成了內皮細胞失常時的增殖。從這個層面說起，TGF-β對早期糖尿病視網膜有一定的保護作用[21]。新生血管的形成則是PDR期的主要病理生理基礎，相關研究證明，TGF-β可能通過以下機制促進PDR的形成及發展：①生長調控作用：TGF-β可以促進RPE、巨嗜細胞、纖維細胞異常增生。RPE可生成BFGF、VEGF等新生微血管形成的重要促進因子。纖維細胞可促進Ⅰ型、Ⅳ型、Ⅴ型膠原蛋白及膜型蛋白的增生。②細胞外基質：TGF-β可直接促進纖維連接蛋白(FN)、膠原蛋白細胞外基質的增多，抑制包括纖溶酶原、膠原酶原、基質酶原等酶原激活物的產生，抑制蛋白水解酶生成，使細胞外基質成分生成生成大于分解，從而造成細胞外基質沉積。③趨化和黏附作用：Mita等發現，TGF-β活化FN的啟動子，促進FN同膠原基質間互相黏附；TGF-β是單核細胞、巨噬細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞有效的趨化因子，這些細胞能釋放vEGF等新生血管生長因子。④免疫調節：TGF-β1表達于各種免疫細胞如巨噬細胞、樹突狀細胞、淋巴細胞等，并通過自分泌或旁分泌形式調節這些細胞的增殖、分化和激活，并且可以調節黏附分子的表達，進而促進其參與的炎性細胞的趨化。除TGF-β1自身在DR形成中發揮作用，TGF-β/Smad 信號通路也起著重要作用。Saika等發現，在基因敲出Smad3的實驗小鼠小鼠模型中，未檢測到Ⅳ型膠原蛋白、FN蛋白、α-平滑肌肌動蛋白及細胞外基質蛋白。且在增殖性玻璃體視網膜病(PVR)的Smad7過度表達的小鼠視網膜色素細胞內，Ⅰ型膠原和α-平滑肌肌動蛋白的表達均較正常組降低；由此可見，Smad3可促進DR的形成，而Smad7對DR具有保護作用。研究TGF-β及其TGF-β/Smad信號傳導通路將會為未來DR的防御與治療提供新的思路。

3 TGF-β在DF中作用機制

DF是糖尿病微血管病變之一，是在不同程度末梢血管障礙合并神經病變以及感染等共同作用形成的糖尿病慢性嚴重病變。當DF發展到一定程度，則需要通過截肢來挽救患者生命，給糖尿病患者及家庭造成身體、精神經濟負擔。而DF患者慢性創傷遷延不愈成為了防治DF的難題。以往研究證明，通過再生醫療技術(MEBT/MEBO)可能促進了糖尿病患者DF潰瘍的愈合，其原因考慮與動態調節TGF-β1、Smad3蛋白分子的表達水平有關。相關實驗表明，在治療DF過程中，負壓封閉引流實驗組相比傳統藥物清創對照組，其足創傷面積，時間降低，肉芽組織增生增多，且實驗組創面肉芽組織中TGF-β1含量高于對照組。研究[22,23]發現，在慢性難愈合創面中TGF-β1表達及功能均存在異常，TGF-βRⅠ及TGF-βRⅡ表達明顯下降，且敏感性也隨之降低，從而導致創面愈合困難。在TGF-β1聯合臭氧治療DF的實驗中發現，聯合組較單臭氧組創口面積減少，將編碼TGF-β1的DNA質粒給糖尿病鼠創面行皮內注射，結果顯示細胞的增殖速度加快，創面的愈合速度較對照組快[24]。以上研究均說明，TGF-β及其受體表達參與DF創面損傷的修復過程。

DF創面的修復是個復雜的過程，主要包括以下三個主要方面：炎性細胞的遷徙、新生血管的形成以及ECM的重構。目前相關研究表明，TGF-β及其受體在上述三個過程中均有重要的參與：①炎性細胞的遷徙：炎性細胞的遷徙是TGF-β1正反饋釋放的的關鍵途徑。當DF出現潰破時，血管內皮細胞破壞，血小板釋放TGF-β1，TGF-β1進一步趨化包括中性粒細胞、淋巴細胞、吞噬細胞等炎性細胞向創面處聚集，而這些炎性細胞自身又能釋放多的TGF-β1。炎性細胞及其釋放炎性因子對創面早期愈合發揮重要作用。梁清月等[25]研究顯示，DF 潰瘍患者下肢組織中TGF-β1呈低水平。②新生血管的形成：TGF-β1可促進血管新生[26]。TGF-β可促進VEGF、PDGF、Egr-1等促進新生血管形成。③ECM的重構：TGF-β1是成纖維細胞的最強趨化因子，能誘導成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，誘導ECM的重構，引起創面纖維化及創面收縮愈合；基質金屬蛋白酶/組織金屬蛋白抑制酶調控ECM的合成與降解。TGF-β1通過促進TIMPs的釋放，抑制MMPs的酶解活性，促進ECM的合成[27]。而在瘢痕愈合晚期，TGF-β3則通過抑制TGF-β1的過表達，從而避免瘢痕的過度形成。

綜上所述，TGF-β及其相關信號通路可能通過誘導炎癥趨化、調節免疫、促進細胞外基質增殖、新生血管增殖及形成、致纖維化過程促進DN、DR的發生發展；而相反，在DF患者中，TGF-β卻呈現出低表達現象，外源性給予TGF-β及聯合其他傳統療法如臭氧可促進DF患者傷口愈合。在未來，尋找TGF-β及其信號通路有效的活性抑制劑將會為DR、DN的防治提供新的思路，而因TGF-β在DF不同時期所產生的相反的表達結果，決定TGF-β外源類似物及抑制物在DF中的運用局限及謹慎性。總之，TGF-β及其通路因其在體內的廣泛表達及多功能性，也決定其局限性，其在DN、DR、DF的不同時期的臨床防治及運用中還需要更多的實驗數據支撐及探索。