人非小細胞肺癌循環腫瘤細胞系的建立及意義＊—肺癌轉移病因“伏毒”的本質研究

羅 斌，闕祖俊，姚嘉良，施奇惠，田建輝,＊

（1.上海中醫藥大學附屬龍華醫院腫瘤科 上海 200032；2.上海市中醫藥研究院中醫腫瘤研究所上海 200032；3.復旦大學上海醫學院生物醫學研究院 上海 200032）

據2019 年美國癌癥治療與生存統計報告資料顯示，非小細胞肺癌Ⅰ期患者的5年相對生存率為57%，而Ⅳ期患者的5 年相對生存率僅有4%[1]，提示積極阻斷早期肺癌的轉移發生是提高患者整體生存率的關鍵。但目前尚缺乏有效的干預手段[2]，其主要原因是對轉移發生的種子—血液和淋巴系統中循環的腫瘤細胞—研究不夠深入。而目前針對原發灶病理和分子診斷結果設計的各種干預措施實質上均缺乏精準指導，這是導致目前仍缺乏抗腫瘤轉移藥物的關鍵原因[2]。

目前大量臨床研究發現早期腫瘤患者，其外周血中已經存在循環腫瘤細胞（Circulating tumor cells,CTCs）[3]，且CTCs數目與疾病進展和生存預后等相關[4]。課題組研究也發現，早期肺癌患者的外周血中存在較高數目的CTCs，提示需要盡早實施干預[5,6]。Zheng 等研究發現高達80%的轉移性結直腸癌患者在原發腫瘤長至約10 mm3時，就已經向機體的外周循環系統或遠處臟器擴散[7]。由于目前臨床上臨床上較為敏感的影響檢查PET/CT檢測PET-CT檢測下限為2 mm，因此腫瘤細胞簇或小于2 mm的病灶則無法被發現；而此時的患者體內狀態正是復發的萌芽時期，誠如《道德經》所述之“無”的狀態，后來發展至臨床可以檢測出病灶則是“無中生有”的過程。此外，Su 等[8]通過對小細胞肺癌患者外周血中的CTCs 進行單細胞測序，研究發現CTCs 單細胞基因組測序可反應腫瘤組織的基因突變狀況，且CTCs、轉移灶與復發腫瘤組織中的DNA 復制修復通路相關基因頻繁發生突變，提示基于外周血中的CTCs 基因突變狀態進行治療策略的制定可能對腫瘤轉移防治具有一定的作用。故建立CTCs細胞系，研究CTCs 的生物學特性和鑒別出真正導致轉移發生的CTCs 亞群的分子特征，進而基于該亞群的CTCs 開發抗腫瘤轉移藥物，使在外周循環階段的CTCs發生失巢凋亡或誘導已侵入靶器官的CTCs進入靜止期?？傊?，CTCs 細胞系的建立是目前研發抗轉移藥物的關鍵環節。

1 建立首例人源非小細胞肺癌循環腫瘤細胞系[9]

采集非小細胞肺癌患者外周血10 mL，通過離心去除富含血小板的血漿，用Hank’s平衡鹽溶液（Hank’s balanced salt solution,HBSS）重懸細胞后，加入包被有EpCAM 和EGFR 的免疫磁珠混合物進行孵育，然后用HBSS 進行稀釋后，將樣品通過魚骨形芯片，在魚骨形芯片上放置磁鐵用于捕獲結合了免疫磁珠的CTCs，沖洗非特異性結合的細胞，然后撤去磁鐵，收集CTCs[9]。

將捕獲得到的CTCs 轉移至低吸附的96 孔板中，并添加RPMI 1640培養基（含20 ng/mL上皮生長因子EGF，20 ng/mL堿性纖維生長因子FGF2，B27添加劑及1%的抗生素）于37℃、5%CO2、3%O2的培養箱中培養，待CTCs開始增殖時轉至正常氧氣濃度下培養[9]。在嘗試對35 例NSCLC 患者的CTCs 進行了分離和體外培養，最終來自于一位II期女性肺腺癌術后患者的CTCs被培養成功，建立了肺癌循環腫瘤細胞系，命名為CTC-TJH-01，單細胞測序發現CTC-TJH-01細胞來自于原發灶[9]。目前已對該細胞系申請了專利。

2 NSCLC外周血CTCs細胞系的生物學特性探索

2.1 CTC-TJH-01細胞具有休眠、干細胞表型和免疫逃逸的特性

為揭示CTC-TJH-01 細胞的生物學特性，課題組將其與原代肺癌細胞A549和95-D細胞進行了比較研究。鏡下形態學觀測發現CTC-TJH-01 細胞核較大、核輪廓不規則、核仁突出、核質比高，細胞大小顯著大于95-D 和A549 細胞。細胞增殖實驗研究發現CTCTJH-01細胞增殖能力較弱，但與95-D和A549細胞相比，對順鉑和泰素帝的耐藥性更強[10]。此外，課題組還對CTC-TJH-01、95-D 和A549 細胞的表型進行了分析，研究發現CTC-TJH-01細胞處于EMT的中間階段，同時高表達皮型鈣黏蛋白（E-cadherin）和神經元型鈣黏蛋白（N-cadherin），且具有高代謝、干細胞表型和免疫逃逸特征[10]。Laure 等在人結直腸癌循環腫瘤細胞中也觀察到了相同的結果[11]。此外，我們還對CTCTJH-01 細胞分泌的細胞因子進行了研究，發現CTCTJH-01 細胞低表達淋巴細胞招募相關趨化因子CX3CL1，高表達轉移相關細胞因子CXCL5[10]。而前期大量研究發現高表達CX3CL1的LLC細胞可招募CD8+T淋巴細胞、樹突狀細胞、NK細胞的浸潤，進而發揮抗腫瘤免疫活性，抑制腫瘤生長[12,13]。而臨床研究發現CXCL5 的表達水平與肺癌患者的無疾病進展生存期和總生存期相關[14]，CXCL5可促進肺癌的增殖和轉移[15]。通過腫瘤細胞與淋巴細胞進行共培養實驗也證實CTCTJH-01細胞對T淋巴細胞和NK細胞的招募能力顯著弱于95-D和A549細胞；采用siRNA下調CTC-TJH-01細胞上CXCL5蛋白的表達可抑制其侵襲和轉移[10]。

此外，課題組采用聚甲基丙烯酸羥乙基酯（poly-HEMA）建立了CTC-TJH-01 細胞懸浮培養模型，研究發現懸浮培養的CTC-TJH-01細胞具有自身聚集成可逆性的細胞團塊，其結構與類器官相似，此外還具有生長抑制、細胞周期阻滯、失巢凋亡抵抗和對化療藥物不敏感等生物學特征。Aceto 等[16]研究發現，血液中的CTCs 細胞簇是單細胞轉移能力的20～50 倍，而采用鈉-鉀ATP酶抑制劑解離CTC細胞簇可抑制其轉移[17]，提示CTCs 形成細胞簇可能是其抵抗失巢凋亡進而發生轉移的機制，表明基于CTC-TJH-01 細胞建立的類器官模型可用于抗腫瘤轉移藥物的篩選。由此，課題組把阻止CTCs 聚集成簇和失巢凋亡并列為篩選有效藥物的評估指標。

2.2 CTC-TJH-01體內致瘤性和轉移能力評估

為證實肺癌患者來源的循環腫瘤細胞是否具有致瘤性和肺轉移能力，課題組采用模式動物實驗方法，將不同免疫背景的小鼠進行CTC-TJH-01 移植，結果發現細胞通過皮下接種到免疫缺陷小鼠體內，CTCTJH-01 細胞的致瘤率100%；與原代A549 細胞相比，CTC-TJH-01 細胞的腫瘤生長速度較慢，其結果與體外細胞增殖實驗相一致[10]。

此外，課題組還采用CTC-TJH-01 細胞在NOD/SCID小鼠上建立了皮下移植瘤肺轉移模型，結果顯示CTC-TJH-01細胞形成的皮下移植瘤可以轉移到肺[10]。上述研究提示肺癌早期術后患者外周血中已經存在的循環腫瘤細胞具有致瘤性和轉移能力，它們可能是導致肺癌復發與轉移發生的關鍵。然而目前這一觀點尚未受到足夠的重視，導致現有治療策略對于早期肺癌患者的總生存獲益有限。

2.3 NK細胞功能狀態與NSCLC外周血CTCs免疫逃逸密切相關

為進一步驗證CTC-TJH-01細胞是否具有轉移能力，采用不同免疫背景的小鼠進行研究，其中包括免疫正常的C57BL/6 小鼠，T 淋巴細胞缺失的裸小鼠，以及同時缺少T 淋巴細胞和NK 細胞的NOD/SCID 小鼠。然后在相同的實驗條件下通過尾靜脈注射將CTCTJH-01細胞接種到小鼠體內，由于小鼠品系及免疫背景不同，導致其肺部成瘤率也存在很大的差異。結果發現CTC-TJH-01 細胞在C57BL/6 小鼠和裸小鼠的肺部均不成瘤，而在NOD/SCID 小鼠上肺部成瘤率100%[18]。提示小鼠外周血中存在的免疫細胞（如NK細胞）對CTC-TJH-01 細胞具有較大的排斥作用，而CTC-TJH-01細胞可能以休眠的狀態存活于裸小鼠的肺部，但有待進一步驗證。然而，Dewan等研究發現將人源乳腺癌細胞與NK 細胞共注射接種到NOD/SCID小鼠體內，可顯著抑制乳腺癌的生長和轉移[19]。而Alexander 等研究發現NK 細胞可通過釋放IFN-γ和TNF-α來誘導腫瘤細胞進入休眠狀態[20]。Tobias 等也發現NK 細胞可通過穿孔素途徑誘導CTCs 休眠，進而抑制肺癌轉移的發生[21]。此外，Taryn等研究發現在轉移性乳腺癌患者的外周血中，CTCs數目越多，其NK細胞的殺傷活性越低[22]。而Mao 等研究發現基于NK 細胞的免疫治療可減少晚期非小細胞肺癌患者外周血中的CTCs數目[23]。上述研究均提示NK細胞的功能狀態與腫瘤的轉移密切相關，而基于NK 細胞開展免疫治療可能對預防肺癌轉移具有一定的作用。

2.4 建立肺癌轉移類人源化小鼠模型

基于CTC-TJH-01細胞我們正在構建模擬臨床肺癌轉移實際過程的小鼠體內研究模型，即通過提取人外周血單核細胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC），然后將PBMC 與CTC-TJH-01 細胞混合后通過尾靜脈注射接種到NOD/SCID 小鼠體內，進而構建可以體現腫瘤所處免疫內環境的類人源化小鼠模型，基于該模型篩選抗肺癌轉移的藥物。

3 CTCs 細胞系的建立有助于將肺癌精準治療的理念落實到早期術后轉移防治領域

轉移是導致90%惡性腫瘤患者死亡的關鍵因素，目前防治肺癌復發轉移的效率亟待提高[24]。其根本原因是缺乏對轉移發生的機制的認識和精準干預。目前早期肺癌術后患者的治療如化療、生物靶向治療等均針對原發腫瘤細胞進行干預，而作為遠處轉移發生種子的循環腫瘤細胞并沒有作為靶點。早在1869 年澳大利亞科學家Thomas Ashworth 在一例患者血液中發現CTCs 后，近20 年來，該領域發展迅速，CTCs 在肺癌的早期診斷、預后評估、藥物篩選領域都有重要價值[3]，已經和ctDNA、外泌體等一起成為臨床液體活檢的重要組成部分[25]。因此，建立穩定的循環腫瘤細胞系是突破肺癌轉移療效瓶頸的關鍵。

由于外周血中的CTCs數目極為稀少（每毫升血約含有1～100個CTCs）[26]，導致循環腫瘤細胞在體外建系的難度極大，目前僅有乳腺癌、結直腸癌和小細胞肺癌等少數癌腫建立了循環腫瘤細胞系[11,27,28]。而我們課題組建立了非小細胞肺癌的循環腫瘤細胞系，并初步探索了它發生免疫逃逸和轉移的機制。

本研究建立穩定的CTC-TJH-01細胞系對促進肺癌轉移研究具有重要意義。首先是課題組首次建立了人肺癌外周血中的循環腫瘤細胞系，豐富了腫瘤細胞生物學研究內容。其次從中西醫融匯的角度，提出“正虛伏毒”為肺癌轉移的核心病機[29]，而CTC-TJH-01細胞的建立及其生物學特征的驗證，是對“正虛伏毒”學術觀點的有力佐證，實踐了從臨床科學問題出發—提出科學理論—回歸臨床應用的科學研究思路；最后，其重要的意義在于為精準醫學理念指導早期肺癌術后的轉移預防提供了明確靶點，目前課題組正基于CTCTJH-01細胞篩選抗腫瘤轉移的中藥小分子化合物。