AFP、AFP－L3、GP73及DCP蛋白在老年肝癌患者中的表達分析及臨床意義

張巖 鄧黎黎 張壯苗 顏榕辛

（三亞市人民醫院腫瘤內科，海南 三亞572000）

肝癌是老年患者中最常見惡性腫瘤，也是我國發病率最高、危害最大惡性腫瘤之一［1－2］。隨著現代生產和生活方式改變，肝癌發病率和死亡率有逐年升高趨勢。關于肝癌發病機理尚不明確，已有證據顯示其可能與肝炎病毒感染、家族遺傳、過度飲酒、肝硬化等因素相關［3］。肝癌患者早期并無典型臨床癥狀，因此診斷時患者通常處于中晚期。目前臨床上尚無特效肝癌治療手段，患者預后較差。因此，探索肝癌發病相關生物大分子標志物，加強早期診斷準確性對臨床實踐具有重要價值。甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）是胎兒肝臟中合成糖蛋白，但成年人體內含量通常下降到極低水平［4］；甲胎蛋白異質體（AFP－L3）、高爾基體跨膜蛋白73（GP73）和異常凝血酶原（DCP）也是體內與多種惡性腫瘤病理過程相關生物大分子［5－6］，但是目前尚未見到其與老年肝癌患者發病及預后相關性報道。本研究對AFP、AFP－L3，GP73及DCP 蛋白在老年肝癌患者中表達及其與預后相關性進行研究，為臨床治療提供參考。報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨 床 資 料 對 本 院2011 年01 月 至2016 年12月期間診治老年肝癌患者進行研究。60例患者中男38例，女22例，年齡57～69歲，平均（64.6±6．7）歲。所有患者均符合中國抗癌協會肝癌專業委員會頒布《肝癌規范化診療2011版》中關于肝癌診斷標準，并經病理學確認。以本院同期老年肝硬化患者（n＝60）為對照。各組研究對象在平均年齡、性別比例等一般資料方面差異無統計學意義（P＞0．05）。排除標準：嚴重心腎功能異常患者；嚴重代謝功能障礙患者；嚴重認知功能障礙患者；高血壓患者；嚴重糖尿病患者。所有患者均知情并簽署知情同意書，并經醫院倫理委員會批準。

1.2 試劑與儀器 AFP 蛋白檢測試劑盒購自Abcam 公司；AFP－L3蛋白檢測試劑盒購自Omega公司；DCP蛋白檢測試劑盒購自R＆D 公司；GP73蛋白檢測試劑盒購自Elabsciences公司；二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；96孔酶標板購自美國Costar公司；全波長酶標儀購自美國Bio－Rad公司；低溫冷凍離心機購自貝克曼庫爾特公司；低溫冰箱購自三菱集團；移液器購自賽多利斯公司；槍頭購自Thermo Fisher公司。

1.3 免疫組織化學法 腫瘤組織取出后立即用福爾馬林固定，待用。石蠟固定后進行5μm 組織切片，分析不同組織中AFP 及AFP－L3定位及表達。5μm 石蠟切片經過二甲苯脫蠟和梯度乙醇水合（100%、95%、90%、80%、70%）后 將 切 片置 于 枸 櫞酸三鈉：枸櫞酸＝3∶4溶液中用微波進行修復（設置中高火，時間8min），3%雙氧水－甲醇溶液處理切片15min進行封閉滅活酶，加一抗（1∶250）37 ℃，濕盒孵育2小時，加HRP標記二抗（1∶250）孵育1 h，蘇木精復染細胞核，封片，光學顯微鏡觀察、拍照。

1.4 酶聯免疫吸附測定法 抽取各組研究對象清晨空腹靜脈血后1 000轉／min低速離心，分離上層血清，－80 ℃保存待用。建立標準曲線：設標準孔，每個孔中加入樣本稀釋液100μL，第一個孔加標準品100μL，混勻后用加樣器取出100μL 移至第二孔，重復操作至第7孔，最后從第7孔中吸出100μL丟棄，使其最終體積為100μL；加樣：待測樣本孔每個孔加入待測樣本100μL；將反應板充分混勻后置37 ℃2h；洗板：用洗滌液將反應板充分洗滌5次，倒置于濾紙上印干；每個孔中加入第一抗體工作液50μL；將反應板置于37 ℃條件下60min；洗板；每個孔中加入酶標抗體工作液100μL；將反應板置于37 ℃條件下60min；洗板；每個孔中加入底物工作液100μL，置于37 ℃暗處條件下反應5～10min；每個孔加入終止液50μL；在450nm 處測定各孔光吸收值，計算相應濃度。

1.5 回訪 根據患者臨床資料以電話形式對所有老年肝癌組患者進行回訪，生存期以患者接受首次治療時間為起點，計算單位為月，截止日期為2017年1月，截尾值為到截止日期存活患者。

1.6 統計學方法 數據統計采用SPSS19．0軟件進行分析，計數資料用（±s）表示，多樣本比較用單因素方差分析，用Kaplan－Meier分析AFP、AFPL3、DCP和GP73與生存期之間相關性，Long－rank法篩選對肝癌預后有影響因素，并繪制Kaplan－Meier曲線。P＜0．05差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 AFP、AFP－L3蛋白在老年肝癌患者中表達分析 研究發現與對照組老年肝硬化組患者相比，老年肝癌患者組血清中AFP 及AFP－L3蛋白表達明顯升高，且差異存在顯著統計學意義（P＜0．05）。見表1。

表1 AFP、AFP－L3蛋白在老年肝癌患者中表達分析

2.2 GP73及DCP蛋白在老年肝癌患者中表達分析 研究發現與對照組老年肝硬化組患者相比，老年肝癌患者組血清中GP73及DCP 蛋白表達明顯升高，差異有顯著統計學意義（P＜0．05），見表2。

表2 GP73及DCP蛋白在老年肝癌患者中表達分析

2.3 AFP、AFP－L3蛋白在肝癌組織中定位及表達分析 免疫組織化學檢測AFP、AFP－L3蛋白在肝癌組織中定位及表達結果發現，與對照組老年肝硬化組患者相比，老年肝癌患者組織中AFP 及AFPL3蛋白表達（棕色部分）明顯升高。見圖1。

2.4 AFP、AFP－L3與老年肝癌患者預后相關性分析 在對AFP、AFP－L3與老年肝癌患者預后相關性進行分析時發現隨著AFP、AFP－L3蛋白表達升高，患者預后逐漸變差。見圖2。

圖2 AFP、AFP－L3與老年肝癌患者預后相關性分析

2.5 DCP和GP73與老年肝癌患者預后相關性分析 在對DCP 和GP73與老年肝癌患者預后相關性進行分析時發現隨著DCP 和GP73蛋白表達升高，患者預后逐漸變差，見圖3。

圖3 DCP和GP73與老年肝癌患者預后相關性分析

3 討 論

惡性腫瘤已成為威脅老年人健康重要疾病，老年病人多臟器功能差、合并癥多，并發惡性腫瘤后多預后差，死亡率高。如何能在老年人當中早期篩查出惡性腫瘤，并對早期患者進行早期干預和治療，從而達到提高療效，延長生存期目，乃是我們目前迫在眉睫需要解決問題。本研究通過拿老年肝硬化組和老年肝癌組做對照，分析肝癌發病相關腫瘤標記物AFP、AFP－L3、GP73和DCP 蛋白在兩組患者中表達及其與預后相關性研究，以望能對臨床老年肝癌早期診斷和治療提供指導意義。

AFP其在胚胎時期由胎肝合成，出生后血清中AFP含量即顯著下降，一年內達到正常成人水平（＜20ng／mL），而在PHC 發生時則又會急劇上升，是目前公認最好肝癌臨床檢查指標。甲胎蛋白異質體（AFP－L3）是PHC患者血清中AFP主要形式。AFP－L3因包含α1－6巖藻糖殘基，連接N－乙酰葡萄糖胺還原端后與LCA（扁豆凝集素）緊密結合，僅由肝癌細胞產生。本研究發現與對照組老年肝硬化組患者相比，老年肝癌患者組血清中AFP、AFP－L3蛋白表達明顯升高，且差異存在顯著統計學意義（見表1），王軍海等［7］研究中也有相似發現，同時該研究還發現AFP－L3與腫瘤大小密切相關。通過免疫組織化學，在肝癌組織中確實可以定位到AFP、AFP－L3蛋白表達，且其表達量要顯著高于對照組老年肝硬化組患者。

GP73是感染病毒后肝細胞內具有正調節作用固有高爾基蛋白。GP73 主要由膽管上皮細胞表達，無論何種原因引起肝病，患者GP73水平均顯著上調，而所有肝病患者中肝癌患者GP73 水平最高［8］。本研究中，老年肝癌患者組血清中GP73 蛋白表達較對照組老年肝硬化組患者明顯升高。王文鼎等［9］研究中比較了肝癌、肝硬化和健康人體內血清GP73水平，發現肝癌患者血清中GP73 高達（201.9±92.9）μg／L 顯著高于肝硬化患者（76．4±25.5）μg／L 和正常人（29．9±15．0）μg／L。DCP 是一種由于維生素K 缺乏或Ⅱ型拮抗所產生異常蛋白，其氨基末端缺乏Y 一氨基谷氨酸，因而無法像正常凝血酶原一樣與鈣離子結合［10］。老年肝癌患者組血清中GP73及DCP 蛋白表達較對照組老年肝硬化組患者明顯升高。有研究者認為肝癌患者血清中DCP過表達可能機制是肝癌細胞微粒體內維生素K 依賴羧化體系功能障礙，羧化酶活力下降，導致羧化不全，從而形成大量DCP，DCP 對PHC有較高特異性，各種非癌性肝病，繼發性肝癌及良性肝臟腫瘤假陽性極低［11］。GP73 和DCP 在多種惡性腫瘤組織內呈現高表達，且與多種惡性腫瘤病理過程密切相關，對其研究可以有利于發現肝癌發病機制，早診斷早干預［12－13］。

以往研究還發現血清GP73和AFP 等十項腫瘤標志物聯合診斷HBsAg陽性肝癌具有較好準確性［14］，且腫瘤標志物DCP 和AFP 在原發性肝癌 診斷中具有重要價值［15］。李慧等［16］也發現GP73聯合其他腫瘤標志物檢測對AFP 陰性原發性肝細胞癌患者臨床診斷參考意義重大，且肝癌患者血清中GP73與腫瘤組織中JAK－STAT 通路激活密切相關［17］盧凌鵬等［18］也證實血清GP73、DCP和VEGF檢測可協助AFP診斷原發性肝癌，聯合4種標志物檢測可顯著提高原發性肝癌檢出率。本研究中，通過對AFP、AFP－L3、GP73及DCP蛋白表達與患者預后之間關系分析顯示，隨著AFP、AFP－L3、GP73及DCP蛋白表達升高，患者預后逐漸變差。本研究聯合檢測AFP、AFP－L3、GP73 及DCP4 種腫瘤標記物在老年肝癌患者中表達，每一種血清腫瘤標記物都有其獨特優勢，聯合多種血清標記物可以通過優勢互補，有效且準確診斷早期肝癌發展方向。

綜上所述，PHC 發生是一個多因素參與、多步驟復雜過程，AFP、AFP－L3、GP73及DCP蛋白表達可以作為鑒別良惡性腫瘤參考標準，4種腫瘤標記物高表達患者發生肝癌可能性較大，而高表達患者預后較差。對聯合檢測上述指標，可以提高肝癌患者早期檢出率，從而對肝癌早期診斷和早期治療具有重要臨床和實踐價值。