氣管肺泡灌洗液行Xpert MTB／RIF檢測對菌陰肺結核的研究價值

李丹 陳麗茹 劉玉潔

（衡水市第三人民醫院檢驗科，河北 衡水053000）

近年來，纖維支氣管鏡的應用可得到質量較高的標本，應用痰涂片抗酸染色和培養的檢測方法雖然陽性率有所提高，但仍不能滿足臨床工作的需要。如何提高胸腔積液診斷的效率，一直是臨床研究的重點問題。隨著分子生物學診斷技術的發展，新型的分子檢測方法利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增（Xpert MTB／RIF）技術逐步受到國內外廣泛關注，且痰液Xpert MTB／RIF 試驗已被證實診斷肺結核具有較高的診斷效能［1－2］，但在肺泡灌洗液中的試驗數據尚顯不足。我院自引入國內Xpert MTB／RIF檢測系統以來，始終密切關注氣管肺泡灌洗液行Xpert MTB／RIF檢測對菌陰肺結核的診斷作用，現擬創新性研究，以80例疑似肺結核患者為對象，評價支氣管肺泡灌洗液行Xpert MTB／RIF檢測對菌陰肺結核的診斷價值。報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取衡水市第三人民醫院2017年2月至2018年4月期間收治的疑診肺結核患者80例為研究對象，其中男54例，女26例，年齡18～60歲，平均（43.29±8．77）歲。入選標準：（1）具有疑似肺結核的臨床表現（發熱、咳嗽、咯血、胸悶等）；（2）纖維支氣管鏡支氣管肺泡灌洗前3次痰涂片抗酸染色陰性或無痰；（3）胸部影像學改變（肺部陰影、感染或結節）考慮活動性肺結核可能；（4）有纖支氣管鏡術及灌洗術適應癥，取得氣管肺泡灌洗液，接受Xpert MTB／RIF 檢測；（5）臨床各項資料完善；（6）患者或家屬簽署知情同意書。排除標準：（1）合并肺外結核、復治肺結核；合并嚴重的其他感染性疾病；（2）伴發認知功能、交流障礙；（3）既往曾接受抗結核治療；（4）具有精神病、癲癇病史；（5）依從性差。本研究經醫院倫理委員會審核批準通過。

1.2 檢測方法 （1）支氣管鏡檢查：所有患者均進行纖維支氣管鏡（奧林巴斯BF－P30）檢查，仔細觀察各肺段支氣管黏膜病變情況，結合胸部CT 明確病變累及肺段的支氣管，并進行刷檢、涂片，然后實施灌洗，相應支氣管肺段以纖支鏡灌入10～20mL 生理鹽水，并用纖維支氣管鏡負壓吸引回收灌洗液至無菌瓶內，根據患者的實際情況可重復灌洗2～3次，最終確保收集灌洗液約10mL，送醫院實驗室后平均分裝于①、②、③三管中，加入等量消化液，混合均勻。以3 000轉／min離心（離心半徑15cm）20 min后備檢。（2）涂片法、培養法：刷檢及肺泡灌洗液①涂片采用萋尼染色鏡檢（染色液購自珠海貝索生物技術有限公司）找抗酸桿菌（涂片）；肺泡灌洗液②培養采用改良羅氏培養基分枝桿菌培養（培養）；并行菌種鑒定及藥物敏感試驗（drug sensitivity test，DST），詳細步驟參照中國防癆協會基礎專業委員會制定的實驗室檢查規程［3］。（3）Xpert MTB／RIF檢測：將1 mL 肺泡灌洗液③中加入1 mL樣本處理液充分混勻，放置15min并間斷搖晃至樣本完全液化，并以無菌吸管將2mL 液體移入試劑盒中，后者插入Gene Xpert檢測平臺中，輸入樣本相關信息后運行，Gene Xpert儀器自動完成樣本的過濾、洗滌，超聲溶菌釋放出DNA 后與PCR反應試劑混合，以半巢式實時擴增并檢測熒光信號，儀器可于2h后自動給出檢測結果。

1.3 診斷標準及分組 肺結核的診斷標準參照《肺結核診斷標準》［4］，以肺泡灌洗液羅氏培養結果及臨床診斷為最終診斷結果，可分為確診病例、臨床診斷病例2類，其中確診病例為肺泡灌洗液分枝桿菌培養結核分枝桿菌陽性；對于不具備細菌學及病理學診斷證據，但胸部影像學顯示與活動性肺結核相符，具有明顯的臨床癥狀或PPD 強陽性或肺外組織病理證實為結核病，且能夠排除其他肺部疾病的患者可歸為臨床診斷病例。本研究80例患者根據上述檢查結果進行分組，確診病例、臨床診斷病例為肺結核病組，否則為非肺結核病組。

1.4 統計學方法 選用統計學軟件SPSS19．0分析和處理研究數據，計數資料采取率（%）表示，以肺泡灌洗液羅氏培養診斷標準、臨床診斷標準為肺結核陽性標準，統計Xpert MTB／RIF 檢測診斷肺結核的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值及準確性，不同檢測方法對肺結核的診斷效能對比進行χ2檢驗，以P＜0．05為差異有統計學意義；兩種檢驗方法的一致性采用Kappa檢驗，以K≥0．4表示一致性好。

2 結 果

2.1 診斷結果 本研究入選的80例疑診肺結核患者中，確診病例36例、臨床診斷病例22例，即肺結核病組患者58例；余22例為非肺結核病組，包括慢性阻塞性肺疾病7例、普通肺炎6例、支氣管擴張4例、肺癌4例及播散性非結核分枝桿菌肺病1例。

2.2 Xpert MTB／RIF檢測診斷菌陰肺結核的結果 肺結核病組中，36 例確診病例中Xpert MTB／RIF檢測均為陽性，22 例臨床診斷病例中18 例Xpert MTB／RIF檢測為陽性；非肺結核病組中有2例Xpert MTB／RIF檢測為陽性，包括1例肺癌及1例播散性非結核分枝桿菌肺病。以肺泡灌洗液羅氏培養診斷標準、臨床診斷標準為肺結核陽性標準，Xpert MTB／RIF 檢測診斷菌陰肺結核的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值及準確性分別為93.10%、90．91%、96．43%、83.33%、92.50%，均高于80%，其診斷效能明顯優于培養法、涂片法。見表1—4。

表1 培養法與菌陰肺結核診斷結果對比（n）

表2 涂片法與菌陰肺結核診斷結果對比（n）

表3 Xpert MTB／RIF檢測與菌陰肺結核診斷結果對比（n）

2.3 Xpert MTB／RIF檢測利福平耐藥的結果 36例肺泡灌洗液羅氏培養陽性的患者中8例對利福平耐藥，其中2例Xpert MTB／RIF 檢測為敏感，1例耐藥情況不確定。以DST 結果為金標準，Xpert MTB／RIF檢測利福平耐藥的敏感度、特異度為62.50%、89．29%，Xpert MTB／RIF 檢測利福平耐藥與DST 結果一致率為83.33%，Kappa檢驗一致性好（K＝0．59，95%CI＝0．55～0．87）。見表5。

表5 分枝桿菌陽性病例Xpert MTB／RIF檢測利福平耐藥與DST 結果對比（n）

3 討 論

長期以來，肺結核與耐藥肺結核的早期診斷始終是結核領域的有待克服的難題之一，其診斷主要依靠痰涂片抗酸桿菌染色（抗酸桿菌），雖然其是結核病診斷最常用、快速的診斷方法，但其敏感度低，臨床報道在結核分枝桿菌培養陽性標本中靈敏度僅為45%～48%甚至更低［5］，且肺結核患者中，痰液稀少及無痰者占比超過30%，即使誘導排痰有助于增加排痰量，提高痰抗酸桿菌檢出率，但是仍有不少患者無法排除足夠及高質量的痰液［6］。即使可取得痰標本，當前的實驗室診斷技術抗酸染色要求標本的菌濃度高，結核抗體假陰、假陽性率高，羅氏培養法因所需時間長而難以及時進行診斷。隨著支氣管鏡檢查的廣泛開展，直接觀察氣管支氣管受累部位及嚴重程度成為可能，并可完成刷檢涂片、肺泡灌洗及活檢病理等檢查，特別值得關注的是，對于痰液稀少或無法自主排痰的患者而言，氣管肺泡灌洗液已成為必不可少的檢查標本［7－8］。

Xpert MTB／RIF 技術是集樣品準備、標本處理、DNA 提取、定量PCR 擴增和熒光擴增檢測于一身的核酸擴增檢測分析系統，目前主要用于結核分枝桿菌特異核酸以及利福平耐藥基因rpoB 突變檢測，在獨立的反應孔中加入待檢測樣品后2h內即可快速獲取檢測標本中是否含有結核菌及是否對利福平耐藥。此項技術于21世紀以后才得以推廣使用，2014年WHO 發布新的Xpert MTB／RIF 使用指南［9］，明確推薦將其應用于肺結核、兒童結核及肺外結核的診斷及利福平耐藥監測。本研究80例疑診肺結核患者中，培養確診病例36例、臨床診斷病例22例，即以肺泡灌洗液羅氏培養診斷標準、臨床診斷標準為肺結核陽性標準，明確診斷肺結核病組58例，其中36例確診病例中Xpert MTB／RIF檢測均為 陽 性（100%），22 例 臨 床 診 斷 病 例 中18 例（81.82%）Xpert MTB／RIF 檢測為陽性，提示菌陰肺結核患者中Xpert MTB／RIF 陽性檢查率高。Xpert MTB／RIF檢測診斷菌陰肺結核的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值及準確性分別為93.10%、90．91%、96．43%、83.33%、92.50%，均高于80%，其診斷效能明顯優于培養法、涂片法。高春景等［10］的報道顯示，以臨床診斷標準為診斷肺結核的陽性標準，氣管肺泡灌洗液行Xpert MTB／RIF檢測對診斷菌陰肺結核的敏感度、特異度、陽性預測值均高于80%。韓丹等［11］的報道亦顯示，Xpert MTB／RIF檢測結核分枝桿菌診斷肺結核的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值及準確度均優于纖支鏡灌洗液抗酸涂片、結核培養。與本研究結果相符，均表明氣管肺泡灌洗液行Xpert MTB／RIF檢測診斷菌陰肺結核的臨床價值高。

此外，大多數結核分枝桿菌耐藥菌株對異煙肼和利福平耐藥，故結核分枝桿菌耐藥情況可一定程度上作為疑似耐多藥結核病的監測指標［12］，而Xpert MTB／RIF檢測可同時實現結核分枝桿菌和利福平耐藥的檢測。為此本研究進一步將Xpert MTB／RIF檢測的耐藥結果與DST 加過對比，發現以DST 結果為金標準，Xpert MTB／RIF 檢測利福平耐藥的敏感度、特異度為62.50%、89．29%，二者的一致率為83.33%，Kappa檢驗一致性好。陳子芳等［13］對肺泡灌洗液培養陽性的32例患者進行利福平耐藥性檢測，檢測結果顯示利福平耐藥率率12.5%，與Gene Xpert MTB／RIF 檢測結果一致。孫蕊 等［14］的 最 新 報 道 亦 證 實Gene Xpert MTB／RIF與傳統藥敏檢測（固體培養法、傳統比例法）利福平耐藥的結果一致性好（K 值均＞0．5）。

綜上，氣管肺泡灌洗液行Xpert MTB／RIF 檢測對診斷菌陰肺結核及快速判斷是否利福平耐藥有突出的應用價值。