基于生信分析趙琦教授對三仁湯主藥治療結直腸腺瘤的預測研究

郭偉鑫 趙琦 王秀琳 梁江 黃曜勇 楊梅 劉立莉

（1．貴州中醫藥大學，貴州 貴陽550025；2．貴州中醫藥大學笫二附屬醫院，貴州 貴陽550001）

大腸息肉是所有向腸腔突出的贅生物總稱。大腸息肉可分為腺瘤息肉與非腺瘤息肉，而研究表明結直腸腺瘤發展與結腸癌密切相關。多數研究認為息肉的發生與腸隱窩中的腸道干細抱的異常克隆和增殖分化有關［1］。結直腸腺瘤患者往往有大便變形、大便稀溏、大便習慣改變的臨床表現。以寒濕氣候、飲食偏辛辣的云貴地區，趙琦教授認為腺瘤的發生發展與中醫濕聚痰凝，聚而成塊機理相似，臨床使用三仁湯主藥（苦杏仁、薏苡仁、半夏）治療結腸息肉患者能改善其臨床癥狀。但目前缺乏實驗證據其作用機制，本研究擬從該方核心藥物及相關干預基因、CRA 患者與正常人黏膜組織差異基因取交集，通過生物信息分析，理論上探索該方治療CRT 潛在基因靶點，為后續靶點實驗提供理論研究。報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究資料 CRA 患者與正常人黏膜組織差異基因數據集的獲取在公共基因GEO 數據庫（即GeneExpression Omnibus，http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／geo／）數據庫中下載CRA 患者與常人黏膜組織對比研究4塊芯片數據（見表1）。將獲取的數據導入GCBI自帶實驗室分析軟件，按照其生物信息分析模塊構建路線圖（見圖1）進行自動運算分析，獲得4 套芯片中CRA 患者與常人差異基因后取交集①（其中差異分析Q＜0．05，差異倍數1.2，若各條芯片中差異基因＜10，則取并集）。

圖1 生物信息分析路線圖

1.2 三仁湯中主藥潛在靶基因數據集的獲取 以苦杏仁、薏苡仁、半夏為主題詞在BATMAN—TcM（a Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine，http：／／bionet．ncpsb．org／batman－tcm／）、 TCMSP（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，http：／／lsp．nwu．edu．cn）檢索3味藥物化學成分及對應調節基因，各自刪除重復項后取交集。苦杏仁、薏苡仁、半夏分別有113.38．116個化學成分，對應的靶點基因分別為296、131、386個。取交集后得出化學成分2個（亞麻酸、油酸），得出靶基因數據集②共有115個。

1.3 分析方法 將數據集①②取交集后得到3個靶點基因分別為MYC、HNF4A、GCG，將這3 個靶基 因 代 入STRING （functional protein associa－tion networks，https：／／string－db．org，http：／／bionet．ncpsb．org）對其功能、生物過程進行GO 分析（Gene Ontology，表2），信號通路富集KEGG 分析（表3），以及參與生物功能的蛋白相互作用網絡分析（MCODE分析），以上分析取前15條，不足15條者展示所有條目。

2 結 果

2.1 CRA 患者與正常人黏膜組織差異基因數據集 在GEO 數據集檢測見表1。

表1 CRA 患者與正常人黏膜組織差異基因研究芯片

對原始芯片數據，首先進行芯片信號值的預處理與預過濾，然后使用差異分析方法SAM 法，05次對所納入的1．套芯片數據進G 差異基因的篩選。差異基因的篩選條件為P＜0．05，差異倍數≥1.5倍，其中從GSE37364中獲得差異基因8 956個，有3 744個表達上調，5 212個表達下調；從GSE77953中獲得差異基因5 833個，2 878個表達上調，2 955個表達下調；從GSE81804 中獲得差異基因1 044個，有321 個 表 達 上 調，723 個 表 達 下 調；從GSE50592中獲得差異基因5 574個，3 120個表達上調，2 454個表達下調；4塊基因芯片差異基因取交集后得到246個，進行后續的生物信息學分析。

2.2 ①②數據集交集基因生信分析結果

表2 生物過程GO 分析結果

表3 KEGG 通路分析結果

2.3 MCODE分析結果 ①②數據集交集后得到MYC、HNF4A、GCG 3個基因，經擴張相關基因范圍后，MCODE 分析結果如下圖（圖2，圓圈表示基因，連線表示關聯性，連線越多表示作用越緊密，箭頭所指為下游基因，相反則為上游基因），通過后期文獻回顧，我們發現MYC、HNF4A、GCG 參與各種癌癥、腫瘤過程，其中MYC、HNF4A 關系密切，這3個基因同時為TP53上游基因，TP53為明星基因，參與多種癌癥及腫瘤的發生發展，這3個通過同時參與調節TP53，以TP53為樞紐參與結直腸癌通路形成過程。見圖2。

圖2 MCODE分析網絡圖

3 討 論

CRA 當屬于中醫學“腸瘤”、“泄瀉”、“積聚”等范疇，王慶其等［2］認為結腸腺瘤由痰、瘀、濕、毒積聚久而成積形成。在濕寒氣候的貴州西南地區CRA患者以大便稀溏、大便習慣及形狀改變等作為主要臨床癥狀，且CRA 為結腸癌前期階段。趙琦教授以“疾病一病因一病機一方藥”為思想，認為結直腸腺瘤主要病機為痰濕凝聚成塊，病位在腸，發病與脾相關；用三仁湯中杏仁、半夏、薏苡仁為核心藥物，根據臨床兼證及舌脈象加減相關中藥治療該證。三仁湯特點為宣中焦、降肺氣。其中半夏性溫，歸脾胃肺經，有燥濕化痰，消痞散結，降逆止嘔之效，更有學者［3］通過實驗證明半夏成分中凝集素可以抑制結腸癌細胞增殖生長，那么半夏其他成分能否抑制結直腸黏膜異常增生值得探索；薏苡仁性甘淡微寒，歸脾胃肺大腸經，有清熱利濕，除風濕，利水消腫，益肺健脾之效，有學者［4－5］分別通過實驗的方法證實薏苡仁脂可以抑制結腸癌細胞增殖及誘導細胞凋亡，薏苡仁油可治療結直腸癌術后患者，提高免疫力及降低相關腫瘤標志物；杏仁性溫，歸肺大腸經，有降肺氣、祛痰潤腸之效，有學者［6］實驗證明苦杏仁中所含蛋白同樣可以抑制結腸在細胞增分裂且具有濃度依賴性。趙琦教授以三仁湯針對本病從濕論治，以健脾化濕，降氣化痰為治則往往奏效，雖此方藥臨床效果不錯，但針對CRA 組織作用效果與靶點仍未探明。課題組已在前期研究中用生信分析的方法驗證了中藥對骨關節炎的靶基因預測［7］，本研究擬用相同方法進行三仁湯主藥對CRA 的靶點預測。

CRA 目前公認是結腸癌的發展前期，提出“腺瘤一癌序列”學說，Shussmant N 等［8］認為腺瘤一癌序列的形成是基因改變的累積結果。多數研究認為腺瘤與腸道干細胞的過分增殖克隆分化相關，細胞增殖分裂速度超過細胞的凋亡速度從而使腸干細胞在隱窩底部不斷累積，最后突出腸腔形成腺瘤，這與中醫痰濕凝聚成塊病機相似。GEO 數據庫擁有目前大量關于CRA 基因芯片數據，這使我們嘗試尋找治療該病的靶基因成為可能。我們嘗試①②交集獲得相同對應的靶點基因，得到MYC、HNF4A、GCG 3個潛在靶基因，我們通過對這3個靶基因擴展相關基因范圍后進行生物信息分析，生物過程GO 富集發現它們參與了生物高分子、細胞、基因表達正調節代謝過程，這符合上述的腺瘤形成與腸道干細胞異常分裂、增殖相關。KEGG 通路分析發現3個靶點基因與各種癌癥、腫瘤形成相關，其中以MYC 為樞紐與結腸癌形成密切相關，而結腸癌公認與CRA 的發生發展密切聯系，其中MYC與HNF4A 聯系緊密，同時存在于中藥成分亞麻酸中，后期經文獻溯源發現原癌基因MYC 通過改變癌發生的腺瘤階段的代謝過程，MYC 的異常表達改變結直腸黏膜細胞代謝重編程而導致腺瘤、癌的發生發展，Satoh K 等［9］發現抑制MYC靶標嘧啶合成基因如CAD，UMPS和CTPS等基因從而抑制細胞生長，因此MYC 是治療結直腸腺瘤、癌的潛在靶基因。有研究發現MYC、HNF4A 可能參與了細胞生長、周期調節和有絲分裂，影響疾病進展［10］。M Darsigny等［11］研究發現HNF4A 是在腸道腫瘤發生過程中根除異常上皮細胞對ROS產生抗性的潛在治療靶點。有學者［12］通過本研究相同的方法，發現同正常黏膜基因表達水平相比，GCG 成下調趨勢，可以作為“腺瘤一癌序列”預后和疾病發展的觀察指標。另外MYC、HNF4A、GCG 并不是CRA 的孤立靶基因，經過分子功能GO 分析，它們均具有蛋白結合功能，參與CRA 形成過程，通過MCODE 網絡分析，它們以TP53為樞紐參與了結直腸腺瘤一癌序列過程。

綜上，通過生物信息分析及文獻溯源，我們得知MYC、HNF4A 參與了CRA 細胞生長、周期調節等過程，GCG 可作為CRA 疾病發展的觀察指標，3個潛在靶基因以蛋白結合，以MYC 為樞紐、核心靶點參與了CRA 與結直腸癌形成過程，以上闡述杏仁、薏苡仁、半夏治療CRA 潛在機制，為后續實驗研究提供方向。受趙琦教授“疾病—病因—病機—方藥”思想和現代藥理學家通過藥物成分及結構推知藥理作用啟發，本研究通過數據庫將CRA 患者與正常人黏膜組織差異基因群、三仁湯中具體中藥成分干預疾病基因群取交集后進行GO、KEGG、網絡分析等生物信息分析，找到具體中藥治療CRA潛在基因靶點具有積極意義。然而此研究仍存在一些不足，第一從GEO 數據庫納入芯片數據較少，無法涵蓋所有CRA 患者與常人黏膜組織所有差異基因數據；第二從BATMAN、TCMSP收錄的杏仁、半夏、薏苡仁對應的藥物成分及調節基因也有可能出現遺漏；第三獲得的潛在靶基因及相關蛋白人體內受影響是多方面的，差異度大并不意味與CRA進展與療效直接相關。這三點促使我們有必要在細胞或動物實驗中進行驗證與探索。