微生物1,3-1,4-β-葡聚糖酶蛋白質改造及工業應用研究進展

鈕成拓，李昕玥，許鑫，包敏，李永仙，劉春鳳，鄭飛云，王金晶，李崎,3

微生物1,3-1,4-β-葡聚糖酶蛋白質改造及工業應用研究進展

鈕成拓1,2，李昕玥2，許鑫1,2，包敏1,2，李永仙1,2，劉春鳳1,2，鄭飛云1,2，王金晶1,2，李崎1,2,3

1 江南大學 生物工程學院 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122 2 江南大學生物工程學院，江蘇無錫 214122 3 江南大學 食品安全與營養協同創新中心，江蘇 無錫 214122

1,3-1,4-β-葡聚糖酶 (E.C.3.2.1.73) 是一種重要的工業用酶，其可以通過特異性切割毗鄰β-1,3-糖苷鍵的β-1,4-糖苷鍵將β-葡聚糖或地衣多糖降解為纖維三糖和纖維四糖。微生物β-葡聚糖酶屬于糖苷水解酶家族16，其三維結構為卷心蛋糕狀的逆向β-片層結構。文中綜述了近些年來β-葡聚糖酶在工業上的應用情況及酶蛋白質工程改造的研究進展，并對其研究前景進行了展望。

1,3-1,4-β-葡聚糖酶，工業應用，蛋白質改造，穩定性，催化性質

生物質資源是地球上最豐富的資源之一，其主要以纖維素和半纖維素等多糖形式存在[1]。目前認為針對多糖的有效降解主要有如下兩個手段，一為加速纖維素和半纖維素的釋放，二為將多糖快速水解為寡糖[2-4]。糖苷水解酶是降解多糖的主要酶系，決定了其在工業上具有廣泛的應用價值，例如在食品行業(果汁行業、大豆產品開發、啤酒行業和酒類產品)、飼料行業、農業工業副產品加工(生產生物燃料等) 和農副產品廢品降解等[5]。

β-葡聚糖是自然界多糖的重要組成部分，其是禾本科植物(特別是高價值經濟作物，如大麥、黑麥、高粱、大米和小麥) 細胞壁的重要多糖組分[6]。β-葡聚糖是多達1 200個β-D-葡萄糖殘基通過1,3-β-糖苷鍵和1,4-β-糖苷鍵連接形成的線性多糖(其中β-1,3糖苷鍵的比例占25%–30%)，其結構與冰島地衣地衣多糖相似[7]。β-葡聚糖可分為水溶性β-葡聚糖和水不溶性β-葡聚糖，其中水溶性β-葡聚糖主要存在于谷物完整胚乳細胞壁中，而水不溶性β-葡聚糖則與蛋白質結合存在于谷物胚乳細胞間[6,8]。水溶性β-葡聚糖溶于水后具有分子量大和黏度大等特點，給工業生產帶來很多困難[6]。目前根據切割糖苷鍵類型的不同將降解β-葡聚糖的糖苷水解酶分為以下4種：1,4-β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)、1,3-β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.39)、1,3(4)-β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.6) 和1,3-1,4-β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.73)。在4種β-葡聚糖降解酶中，1,3-1,4-β-葡聚糖酶(下稱β-葡聚糖酶) 的催化活性最高，因此具有最廣泛的應用價值。β-葡聚糖酶通過特異性切割1,3-β-糖苷鍵毗鄰的1,4-β-糖苷鍵將β-葡聚糖或地衣多糖降解為以纖維三糖和纖維四糖為主的低聚葡萄糖[9]，因此可以消除β-葡聚糖黏度高的特點，在以谷物為主要原料的行業中有重要應用價值[6,10]?；诖俗饔茫?葡聚糖酶作為半纖維素酶系的重要組成部分在生物質能源的生產過程中同樣可以與其他酶系協同作用將木質纖維素降解為可發酵性糖[11-12]或生物燃料[13]。另一方面，β-葡聚糖酶降解β-葡聚糖產生的低聚葡萄糖作為益生元對人體具有有益的性質[14-16]。

β-葡聚糖酶主要來源于高等植物和微生物，然而植物酶和微生物酶的結構特點完全不同。植物β-葡聚糖酶屬于糖苷水解酶家族17，為(β/α)8桶狀結構[6,17]；而微生物β-葡聚糖酶屬于糖苷水解酶家族16，為三明治夾心結構[18]。微生物β-葡聚糖酶的熱穩定性和催化活性均優于植物來源酶[10]，然而目前篩選得到微生物β-葡聚糖酶的熱穩定性、pH耐受性和催化活性依舊不能滿足工業上的應用要求。近年來通過定點突變等蛋白質工程改造手段對β-葡聚糖酶進行改造已經取得一定成效，部分酶在工業上取得了良好的應用效果。在之前研究中，Planas[10]和孫軍濤等[19]分別對β-葡聚糖酶的結構、催化機制、理化性質和部分酶學性質改造的工作進行了綜述，而鈕成拓等[20]對β-葡聚糖酶催化活性提高的方法和成果進行了總結。文中總結了本實驗室和其他研究團隊對β-葡聚糖酶的研究工作，主要對微生物β-葡聚糖酶的工業應用情況和蛋白質工程改造進行了綜述，旨在為高效β-葡聚糖酶制劑的構建提供參考。

1 β-葡聚糖酶的工業應用

β-葡聚糖在工業應用上會造成不利影響，同時也是一種重要的非淀粉多糖。基于β-葡聚糖酶的作用方式和產物特點，β-葡聚糖酶主要在3類工業中具有應用價值。在第一類應用領域中，β-葡聚糖的存在不利于工業操作，而β-葡聚糖酶通過降解β-葡聚糖消除其不利作用從而促進工業生產，例如啤酒和飼料行業。在第二類應用領域中，以通過β-葡聚糖酶降解作用得到的低聚葡萄糖作為主要目標產物，例如益生元行業。在第三類應用領域中，以β-葡聚糖酶降解得到的低聚葡萄糖作為底物供進一步生物技術加工，如生物乙醇和生物柴油行業。

1.1 酒類行業

在啤酒釀造過程中，麥芽內源β-葡聚糖酶在麥芽烘焙和麥汁糖化過程失去活力，大量β-葡聚糖殘留在麥汁中，導致麥汁黏度過高，且其會與麥汁中高分子量蛋白質結合壓緊麥糟，使麥汁過濾困難[6,21-22]。在啤酒發酵過程中，β-葡聚糖無法被酵母利用且會誘使酵母過早沉降，影響發酵效果。在成品啤酒中，β-葡聚糖會與殘留蛋白質 結合形成霧狀物質，影響成品啤酒的非生物穩定性[6,23]，β-葡聚糖的殘留同時是造成成品啤酒泡沫掛杯性和泡沫穩定性差的主要原因[24]。研究者將篩選得到的微生物β-葡聚糖酶在啤酒釀造過程中進行了應用，取得了良好的效果。Bai等[25]和Chaari等[26]分別將脂環酸芽孢桿菌sp. A4和青霉菌Pol6來源β-葡聚糖酶在麥汁協定糖化過程中進行了應用，發現相同活力微生物β-葡聚糖酶和商業酶(Ultraflo或Finizym) 的添加對于麥汁過濾速度的提高和麥汁黏度的降低效果幾乎相同。鈕成拓等[6,27]將特基拉芽孢桿菌CGX5-1來源β-葡聚糖酶添加在麥汁協定糖化過程開始階段，最后將過濾時間和麥汁黏度分別降低了29.7%和12.3%，其應用效果優于兩種商業酶。研究者將小孢根霉var.[28]和埃默森籃狀菌[29-31]來源β-葡聚糖酶在麥汁糖化過程中進行了應用，同樣取得了良好的效果。

在葡萄酒釀造過程中，葡萄皮/果肉細胞壁多糖和污染灰葡萄孢屬微生物的葡萄產生的多糖會與蛋白質結合形成難溶性顆粒狀物質，導致葡萄酒過濾困難，影響葡萄酒的澄清度，影響成品葡萄酒的非生物穩定性[6,32]。Liauberes等[33]將含β-葡聚糖酶的復合酶制劑在葡萄酒生產過程中進行應用，發現酶制劑的添加不僅使葡萄酒的澄清、過濾更為容易，同時減少了過濾助劑的使用量。在皮渣浸泡之后的葡萄汁中添加β-葡聚糖酶使發酵后的葡萄酒具有更理想的香氣[34]。

1.2 飼料行業

在飼料行業中，大麥在飼料中的應用逐漸規?；?。然而，谷物中的β-葡聚糖在動物腸道中無法被有效吸收和利用(動物腸道缺乏降解β-葡聚糖相關酶類)[35-36]，與此同時β-葡聚糖較高的持水性會導致哺乳動物及禽畜類腸道內液體黏稠，作為“抗營養因子”阻礙飼料營養成分被動物腸道吸收，影響飼料利用效率和動物營養吸收效率[37]。β-葡聚糖存在于動物腸道中同時為腸道有害細菌的繁殖提供營養，而有害細菌的繁殖也會競爭性消耗飼料營養，造成動物腸道菌群失調并影響動物營養吸收，最終導致動物胃腸道疾病[38]。對于飼料中β-葡聚糖的降解關鍵酶為1,3-1,4-β-葡聚糖酶還是1,4-β-葡聚糖酶在前期研究中頗有爭議。針對此問題，Fernandes等[39]在大腸桿菌中重組表達了熱纖梭菌來源1,3-1,4-β-葡聚糖酶(CtGlc16A) 和1,4-β-葡聚糖酶(CtCel8A) 并將兩種酶添加在肉雞飼料中，結果發現CtGlc16A對于以大麥為主的飼料黏度降低能力遠優于CeCel8A，這說明1,3-1,4-β-葡聚糖酶是提高大麥飼料營養價值的關鍵酶。經過研究發現，β-葡聚糖酶添加于肉雞飼料中不僅可以提高飼料利用效率，同時肉雞的日增重速度、腸道黏度和飼養成本均優于未添加酶對照組[40-42]。近年來發現β-葡聚糖酶在飼料中的添加同時具有以下功效：1) 新型低價值向日葵或油菜籽在飼料中有效利用[43]；2) 緩解蛋雞使用小麥飼料時的骨質礦化現象[44]；3) 表達高耐熱β-葡聚糖酶的轉基因大麥在飼料中添加與傳統玉米飼料效果相似[45]；4) β-葡聚糖酶可以提升動物氧化還原穩態，促進動物腸道營養吸收，從而提升動物免疫力[46]。Clarke等[47]將β-葡聚糖酶添加于肥育豬飼料中，其明顯改善了豬的營養吸收率和生長情況，進一步研究發現，和對照組肥育豬相比添加β-葡聚糖酶大麥飼料組肥育豬腸道營養吸收相關基因均明顯上調。Guan等進一步將多粘類芽孢桿菌CP7來源β-葡聚糖酶在仔豬腮腺中進行了異源表達，發現轉基因豬對β-葡聚糖和其他營養物質的攝取和吸收能力明顯提高，降低了β-葡聚糖的抗營養因子作用[37,48]。Zhang等[49]將耐酸β-葡聚糖酶基因在玉米中進行了異源表達，轉基因玉米β-葡聚糖酶酶活是非轉基因玉米對應β-葡聚糖酶酶活的236倍，且其最適pH值為4.0，符合動物消化系統酸性環境，這為玉米在飼料中的高效應用奠定了基礎。

1.3 益生元行業

通過β-葡聚糖酶將β-葡聚糖降解為低聚葡萄糖，對人體健康產生益處。研究發現，攝入低聚葡萄糖可以降低血清膽固醇[50]、提高機體免疫力[51]、提高人體抗菌消炎和抗氧化能力[52]。與此同時，低聚葡萄糖可以促進人體腸道內有益微生物(主要為雙歧桿菌和乳桿菌等) 的選擇性生長，緩解或治愈人類相關疾病[53-54]。Cho等[55]和Chaari等[56]分別將芽孢桿菌屬sp.和青霉菌Pol6來源β-葡聚糖酶進行固定化并用于低聚葡萄糖的生產，發現固定酶具有和游離酶相同的酶學性質且酶活穩定性較好，得到的低聚葡萄糖具有較高的抗氧化能力，且對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、肺炎克雷伯氏菌和鼠傷寒沙門氏菌具有較高的抑菌活性。Kim等[14]進一步將聚合度為3和4的低聚葡萄糖添加在糖尿病大鼠的飼料中，發現其可以顯著降低大鼠的膽固醇含量，這說明低聚葡萄糖具備抗高膽固醇血癥、抗高甘油三酯血癥和降血糖等功效，可為新型生物健康產品開發奠定基礎。

1.4 生物燃料行業

隨著近年來對能源需求的提升，通過酶法將生物質能源降解生產生物燃料成為研究熱點[57]。降解生物質的酶系主要包括纖維素酶系和半纖維素酶系[4]。在半纖維素酶系中，β-葡聚糖酶(地衣多糖酶)可與木聚糖酶、昆布多糖酶等協同作用降解半纖維素，為生物乙醇或生物柴油的生產奠定基礎[3,58-59]。盡管目前研究主要集中在纖維素降解酶系中，但是從經濟效益的角度來看同時利用半纖維素(木質纖維素中含量第二高的多糖組分)可以取得更好的經濟價值。與此同時，半纖維素通常包裹著纖維素，只有將半纖維素降解后才能啟動纖維素的降解過程[60]。由此可見，作為一種重要的半纖維素降解酶，β-葡聚糖酶是一種降解生物質資源生產生物燃料的重要酶類。

近年來研究者已經篩選得到多株具有發達的降解木質纖維素酶系的菌株。通過色譜分析發現其中具有較高木質纖維素降解能力的一株煙曲霉Z5中β-葡聚糖酶具有最高的酶活[3]。Li等[13]將β-葡聚糖酶與木聚糖酶進行協同作用，將玉米秸稈降解為木糖、低聚葡萄糖和葡萄糖，從而供酵母菌株轉化生成生物乙醇，結果發現碳水化合物向生物乙醇的轉化率達到84%。Menon等[61]采用堿性嗜熱單胞菌屬sp.來源β-葡聚糖酶與β-葡萄糖苷酶協同作用，以地衣多糖為底物生產生物乙醇產量達到0.450 2–0.480 2 g/g，達到理論轉化率的93%–96%。

1.5 其他行業

β-葡聚糖酶在生物防治、制糖行業等領域同樣具有一定效果。在生物防治領域，β-葡聚糖酶可以通過降解或抑制真菌細胞壁1,3-β-葡聚糖的合成抑制真菌細胞的生長周期，從而抑制真菌生長[6]。Enrique等[62]分析了市售β-葡聚糖酶對于常見葡萄酒污染酵母 (如白色隱球菌、布魯塞爾德克酵母菌、膜醭畢赤酵母、釀酒酵母、拜爾接合酵母和雙孢酵母) 的影響，發現β-葡聚糖酶對布魯塞爾德克酵母和拜耳接合酵母具有明顯抑制作用，與此同時酶在葡萄酒中的添加對葡萄酒品質并沒有影響。在制糖工業中，被腸膜明串珠菌污染的蔗糖液體會產生大量高黏度β-葡聚糖，β-葡聚糖酶添加在甘蔗制糖過程中可以迅速除去榨糖物料中的β-葡聚糖，大幅減少蔗糖的損失，提高了經濟效益[63]。

2 β-葡聚糖酶的酶學性質改造

β-葡聚糖酶在工業上的高效應用取決于其能否在工業應用環境中維持較高的催化活性。工業應用環境通常存在一些不利于酶應用的特點，例如高溫、pH環境等。在啤酒行業和飼料行業中，β-葡聚糖酶通常應用于麥汁糖化過程中或添加于飼料中。麥汁糖化溫度通常從48 ℃逐漸提升至78 ℃，而飼料造粒溫度在60–90 ℃。與此同時，麥汁是一種弱酸性液體(pH 5.0–5.5)，而動物消化系統通常也為酸性環境。對β-葡聚糖酶酶學性質進行改造使其更適應工業應用環境將更有利于其在工業上的應用效果。近年來，研究者通過新酶篩選、非理性/半理性/理性改造、計算機模擬等手段對β-葡聚糖酶的酶學性質進行了分析和改造，取得了一定成果。

2.1 新酶篩選

芽孢桿菌屬sp.是β-葡聚糖酶的主要來源，其分子量通常在25–30 kDa[64]。絕大部分芽孢桿菌屬β-葡聚糖酶的最適pH值集中在pH 6–7.5，最適溫度集中在45–65 ℃，而比活力值通常在1 200–4 500 μmol/ (min·mg)[10]。以β-葡聚糖為底物時β-葡聚糖酶的m值為1.2–1.5 mg/mL，而以地衣多糖為底物時酶的m值為0.8–2 mg/mL[65-67]。近年來，研究者逐步從非芽孢桿菌屬(Non-sp.)中分離得到大量β-葡聚糖酶。和芽孢桿菌屬來源β-葡聚糖酶相比，非芽孢桿菌微生物來源酶通常具有一些具備其他功能的蛋白質區域[68]。然而，目前發現絕大部分非芽孢桿菌屬微生物來源β-葡聚糖酶的酶學性質與芽孢桿菌屬微生物來源酶性質相似，其最適pH值和最適溫度 集中在pH 6.0–10和45–60 ℃[68-70]。熱纖梭菌[36]、埃默森籃狀菌[31]和嗜熱擬青霉[71]來源的β-葡聚糖酶的最適溫度分別達到80 ℃、80 ℃和70 ℃，其最適pH值分別為6.6–10、4.8和7.0，然而其催化活性較低。

2.2 β-葡聚糖酶的熱穩定性改造

Planas已經對β-葡聚糖酶熱穩定性的改造進行了一定的描述。研究發現蛋白質N端和鈣離子對 β-葡聚糖酶熱穩定性有重要影響。Borriss等[65-66,72]發現將淀粉液化芽孢桿菌來源β-葡聚糖酶N端16個氨基酸替換地衣芽孢桿菌來源酶對應區域可以大幅提升酶的熱穩定性，進一步分析發現酶N端Gln1、Thr2、Ser5和Phe7位點通過構建N端-核心區域氫鍵網絡和N端-C端氫鍵網絡維持β-葡聚糖酶的穩定性[73]。Pons等[74]將β-葡聚糖酶分子內部二硫鍵Cys61-Cys90打斷，發現二硫鍵對酶的催化性質和穩定性均沒有太大影響。鈣離子的喪失會大幅降低β-葡聚糖酶的熱穩定性，而其對酶的催化性質幾乎沒有影響。Keitel等[75]采用Na+替代雜交酶H (A16-M) 中的Ca2+，結果酶在高溫下的半衰期顯著下降。通過差示量熱法，Gargallo等[76]發現鈣離子的存在明顯改變了β-葡聚糖酶在高溫下的解折疊過程。β-葡聚糖酶在鈣離子存在時高溫解折疊過程中出現了一個中間體狀態，為兩步解折疊，而當鈣離子不存在時其為一步解折疊。對于Asp51-Arg64無規卷曲的精氨酸突變實驗發現Asn57為高溫下不穩定性氨基酸，將其突變為精氨酸后酶的熱穩定性有所提升[73]。

近年來研究者進一步通過非理性、半理性和理性手段對β-葡聚糖酶的熱穩定性進行了改造。張秀艷等[77]采用隨機突變結合DNA改組技術對枯草芽孢桿菌ZLF-1A5來源β-葡聚糖酶進行體外進化改造并建立一種高通量篩選耐高溫β-葡聚糖酶的方法，獲得的EGs1和EGs2突變體的m值和野生酶相比分別提高了3 ℃和5 ℃[78]。Chen等[79]對產琥珀酸絲狀桿菌來源β-葡聚糖酶氨基酸保守序列進行了分析和突變研究，發現Gly63對酶熱穩定性有較大作用。Gargallo等[76]對芽孢桿菌屬來源β-葡聚糖酶進行了分子動力學模擬研究，發現β-葡聚糖酶N端和C端區域的根平均偏差值(Root mean square deviation，RMSD) 偏高，說明其酶N/C兩端有較高的結構柔性，可能對于酶的熱穩定性有影響。在此基礎上，Wen等[80]和李衛芬等[81]分別將產琥珀酸絲狀桿菌和熱纖梭菌來源β-葡聚糖酶的N端和C端區域逐步截去，發現β-葡聚糖酶N端和C端區域對酶熱穩定性有一定貢獻且具有疊加效應。

近年來本研究室對芽孢桿菌來源β-葡聚糖酶進行了一系列改造，成功獲得了熱穩定性提高的酶突變體。秦久福等[82]采用易錯PCR技術對淀粉液化芽孢桿菌BS5582來源β-葡聚糖酶進行定向進化改造，得到的3株酶突變體的m值和野生酶相比分別提高了2.2 ℃、5.5 ℃和3.5 ℃。鈕成拓等[83]采用亞硝酸作為修飾劑對淀粉液化芽孢桿菌BS5582來源β-葡聚糖酶進行了化學修飾研究，推測酶蛋白質表面賴氨酸對酶的熱穩定性有重要影響。在此基礎上，采用定點突變方法將特基拉芽孢桿菌CGX5-1來源β-葡聚糖酶表面賴氨，發現20位、117位和165位賴氨酸突變后其蛋白質總能量值和氫鍵數量均優于野生酶，K20S/K117S/K165S組合突變體的最適溫度和50值與野生酶相比分別提高了15 ℃和14 ℃[6,84]?；诘鞍踪|結構和柔性分析，鈕成拓等在β-葡聚糖酶三維結構中引入了二硫鍵N31C-T187C和P102C-N125C，其m值和野生酶相比分別提高了1.4 ℃和2.3 ℃[85]。β-葡聚糖酶自身二硫鍵對于熱穩定性沒有影響，然而該兩對二硫鍵的引入成功提高了β-葡聚糖酶的m值。對β-葡聚糖酶結構中的二硫鍵進行分析，發現二硫鍵Cys61-Cys90主要處于蛋白質凹側β-片層區域，結構相對穩定，打斷其對于酶結構穩定性影響較小。二硫鍵N31C-T187C和P102C-N125C主要連接β-葡聚糖酶高柔性區域，通過分子動力學模擬發現將其引入酶結構后可以一定程度降低酶的整體柔性。因此在合適的位置引入二硫鍵可以提高β-葡聚糖酶的熱穩定性。為了解析β-葡聚糖酶熱穩定性關鍵區域和氨基酸位點，鈕成拓等[6,86]建立了一種基于同源蛋白質氨基酸序列比對、空間結構區域化和分子動力學模擬的突變熱點區域分析法(Spatial compartmentalization of mutational hotspots) 對微生物β-葡聚糖酶熱穩定性關鍵區域和氨基酸位點進行了分析，發現β-葡聚糖酶結構凸側鈣離子結合區域與酶熱穩定性具有較高的相關性，這說明該區域可能是微生物β-葡聚糖酶熱穩定性關鍵區域。通過定點突變方法將該區域內6個氨基酸位點突變為高耐熱β-葡聚糖酶對應氨基酸位點，發現40位、43位、46位和205位氨基酸位點對酶熱穩定性具有重要的影響，說明這4個位點可能為酶熱穩定性關鍵氨基酸位點。采用迭代飽和突變手段對這4個氨基酸位點進行改造，得到的組合突變酶E46P/S43E/H205P/S40E的最適溫度、m值和50值與野生酶相比分別提高了20 ℃、13.8 ℃和14.5 ℃，其在60 ℃和70 ℃的半衰期是野生酶的3.86倍和7.13倍[6]。最后鈕成拓[6,27]將上述酶熱穩定性有利突變位點進行了組合突變，得到的組合突變體的最適溫度、50值和m值分別達到70 ℃、81.7 ℃和56.2 ℃，和野生酶相比分別提高了25 ℃、19.7 ℃和15.9 ℃。其在60 ℃和70 ℃的半衰期達到153.2 min和99.6 min，是野生酶對應值的4.71倍和9.05倍。對野生酶和組合突變酶蛋白質結構進行比較和分析，發現鈣離子結合區域帶有更多負電，和鈣離子的結合更加緊密，同時組合突變酶蛋白質中有序二級結構所占比例也有大幅提高，從而提升酶的熱穩定性。根據結合突變熱點區域分析法所得結果和鈣離子替換實驗，推測β-葡聚糖酶與鈣離子結合的緊密度與酶熱穩定性有重要關聯。

2.3 β-葡聚糖酶的催化性質改造

β-葡聚糖酶特異性切割β-葡聚糖的催化機制為包含一個親核氨基酸和一個廣義酸/堿氨基酸 的雙位移機制(Double displacement mechanism)[6]，其催化機制和底物特異性識別位點在Planas發表的綜述[10]中已有明確描述。盡管較多微生物能夠分泌β-葡聚糖酶，但是其催化性質依舊不能滿足工業應用水平。目前對于β-葡聚糖酶催化性質的改造方法主要采用蛋白質工程改造。對近年來研究者對β-葡聚糖酶催化性質改造工作進行分析，發現酶N/C端改造和酶催化活性中心內關鍵分子內作用力的形成對β-葡聚糖酶的催化性質有重要影響。毛淑蕊等[87-88]采用易錯PCR手段對高地芽孢桿菌YC-9來源β-葡聚糖酶進行了定向進化，得到的K142N/Q203L/N214D三突變體的催化活性達到474.6 U/mL，和野生酶相比提高了48.6%，同時其pH性質和熱穩定性均沒有影響。Wen等[80]將產琥珀酸絲狀桿菌β-葡聚糖酶C端截斷，并在畢赤酵母中進行了表達，結果發現截斷酶的cat值是全長酶的3–4倍。在畢赤酵母中表達的截斷酶是一種糖基化酶，其比活力值達到(10 800±200) U/mg，而對于底物地衣多糖的親和力(m值) 和全長酶沒有差別。

本研究室在對β-葡聚糖酶進行熱穩定性改造的同時，發現部分氨基酸位點的變化對酶的催化性質造成影響。針對β-葡聚糖酶賴氨酸改造過程中，發現20位、117位和165位賴氨酸突變為絲氨酸后其比活力值和cat值與野生酶相比分別提高了58.1%和34.6%，而其m值有一定程度的降低[84]。通過突變熱點區域分析法改造得到的E46P/S43E/H205P/S40E突變位點的引入將β-葡聚糖酶的比活力值和cat值從2 490.1 U/mg和137.4 /s分別提高至4 093.8 U/mg和187.4 /s，m值從297 μmol/L降低至271 μmol/L。最后得到的組合突變酶的比活力值則進一步提高至4294.1 U/mg[86]。對于野生酶和酶突變體的結構(特別是催化活性中心) 進行分析和比較，盡管突變位點位于蛋白質表面，但是改造后突變酶的二級結構，特別是催化活性中心部分發生了改變。酶突變體催化活性中心有序二級結構比例稍有提高，柔性降低，部分與底物結合氨基酸位點所處微環境發生變化，并形成了部分關鍵氫鍵(如E109-Q119和W103-E105等)，這可能是突變提高β-葡聚糖酶催化性質的主要原因[27]。

2.4 β-葡聚糖酶的pH性質改造

β-葡聚糖酶在酒類[89]、飼料[90]和生物燃料[91]生產行業中主要應用在酸性環境，而在洗滌劑等行業中通常需要適應堿性環境[92]，因此這需要β-葡聚糖酶具有不同的pH性質。盡管在BRENDA等酶數據庫中能夠找到一些最適pH值為pH 4–5的β-葡聚糖酶，然而其熱穩定性或者催化活性均存在缺陷。目前針對β-葡聚糖酶的耐酸性或耐堿性的蛋白質改造的研究較少。江正強等[93]采用易錯PCR手段對嗜熱擬青霉來源β-葡聚糖酶的耐酸性進行了分析，發現56位和263位氨基酸對于酶的最適pH值改變有重要影響，發現突變體PtLic16AM2的最適pH值(pH 5.0)和野生酶(pH 7.0)相比有所降低。在本研究室對特基拉芽孢桿菌CGX5-1來源β-葡聚糖酶進行改造過程中，組合突變酶的最適pH值從6.5降低至6.0。對蛋白質結構進行分析，發現酶突變體的蛋白質表面帶有更多的負電荷，這可能是酶最適pH值向酸性環境移動的主要原因[27,85]。

3 總結與展望

β-葡聚糖酶是一種重要的工業用酶，在酒類、飼料、益生元等行業中具有重要應用價值?，F代工業生產中的高溫、酸性/堿性pH環境等對β-葡聚糖酶的熱穩定性、pH性質和催化活性提出了更高的要求。近年來通過蛋白質工程改造技術在提高β-葡聚糖酶熱穩定性和催化性質等領域已經取得了一系列成果，但是目前得到的β-葡聚糖酶酶學性質依然存在缺陷，尤其是β-葡聚糖酶的耐酸性不足，嚴重阻礙了其在工業上的應用。因此，通過蛋白質工程改造技術進一步提高β-葡聚糖酶的酶學性質，使其更貼合于工業生產，將更有利于其在工業中發揮作用。

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Research progresses in microbial 1,3-1,4-β-glucanase: protein engineering and industrial applications

Chengtuo Niu1,2, Xinyue Li2, Xin Xu1,2, Min Bao1,2, Yongxian Li1,2, Chunfeng Liu1,2, Feiyun Zheng1,2, Jinjing Wang1,2, and Qi Li1,2,3

1 Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 2 School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 3Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition,Jiangnan University,Wuxi 214122, Jiangsu, China

1,3-1,4-β-glucanase (E.C.3.2.1.73) is an important industrial enzyme which cleave β-glucans into oligosaccharides through strictly cutting the β-1,4 glycosidic bonds in 3-O-substituted glucopyranose units. Microbial 1,3-1,4-β-glucanase belongs to retaining glycosyl hydrolases of family 16 with a jellyroll β-sandwich fold structure. The present paper reviews the industrial application and protein engineering of microbial β-glucanases in the last decades and forecasts the research prospects of microbial β-glucanases.

1,3-1,4-β-glucanase, industrial application, protein engineering, stability, catalytic property

November 9, 2018;

January 24, 2019

National Natural Science Foundation of China (Nos. 31571942, 31601558, 31771963), Program of Introducing Talents of Discipline to Universities (No. 111-2-06), the Fundamental Research Funds for the Central Universities (No. JUSRP11841).

Qi Li. Tel: +86-510-85918176; E-mail: liqi@jiangnan.edu.cn

國家自然科學基金(Nos. 31571942, 31601558, 31771963)，高等學校學科創新引智計劃(No. 111-2-06)，江南大學基本科研計劃青年基金(No. JUSRP11841) 資助。

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(本文責編 郝麗芳)