甲連盆腔膠囊對慢性盆腔炎大鼠組織學及炎性因子的影響

楊 靜，葉 濤，易 剛，王 磊，李 娟，劉 婭，王永周*

（1.西南醫科大學附屬中醫醫院婦產科，四川 瀘州 646000；2.西南醫科大學附屬中醫醫院骨關節科，四川 瀘州 646000）

慢性盆腔炎（chronic pelvic inflammatory disease，CPID）是女性內生殖器官、周圍結締組織以及盆腔腹膜的慢性炎癥，以不孕、異位妊娠、慢性盆腔痛及盆腔炎性疾病反復發作為主要表現，在我國發病率較高，約40%，近年來盆腔手術的增加，有逐年上升趨勢。該病病程長、易反復，嚴重影響女性的生活質量，以抗生素和手術治療為主的西醫療法副作用大，而中醫藥對此凸顯出明顯的優勢。甲連盆腔膠囊是我院自主研發的中藥復方制劑，已運用于臨床實踐多年，療效確切[1]，本實驗通過建立CPID大鼠模型，旨在從組織學及炎性因子方面探討甲連盆腔膠囊對CPID的療效和可能的作用機制，為其臨床運用提供理論支持和實驗依據。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

雌性未孕清潔級SD大鼠80只，8周齡，體重（200±20）g，由西南醫科大學動物實驗中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（川）2018-17，飼養于西南醫科大學實驗動物中心。

1.1.2 實驗藥物與試劑

甲連盆腔膠囊（由西南醫科大學附屬中醫醫院制劑室提供，批號：20181023）。婦科千金膠囊（生產公司：株洲千金藥業股份有限公司，批號：20181139）。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-2（IL-2）ELISA試劑盒購自上海橋杜生物科技有限公司；戊巴比妥鈉、苯酚、甘油、黃耆樹膠粉等購自中國醫藥集團上海試劑公司。

1.1.3 實驗儀器

DHP-9052恒溫培養箱；5424高速離心機；Model 680酶標儀；Thermo 991超低溫冰箱；80i正置熒光顯微。

1.2 方法

1.2.1 動物分組

數字牌固定于大鼠左側耳緣標號，適應性喂養1周，按隨機數字表法分為空白組、假手術組，每組15只，余50只為造模組。

1.2.2 模型建立及鑒定

50只造模組大鼠參照文獻采用苯酚膠漿法造模[2]。具體方法：大鼠禁食不禁飲12小時，2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射，麻醉滿意后，備皮消毒，下腹正中作一長約2 cm切口，進入腹腔，暴露子宮，眼科鑷夾住左側子宮近輸卵管端，1mL注射器向左側宮腔緩慢推注25%的苯酚膠漿0.02 mL（由液化苯酚、甘油、黃耆樹膠粉制成），分層關腹，消毒術區，放入鼠籠保暖復蘇。假手術組按上述方法開腹，注射同等劑量生理鹽水后關腹。造模10天后，隨機取3只大鼠左側子宮組織，HE染色后，光鏡下觀察，確定造模成功后，再將造模組大鼠隨機分為模型組、婦科千金膠囊組和甲連盆腔膠囊組。

1.2.2 給藥干預

造模第11天開始灌胃，干預組大鼠灌胃量按照成人60 kg所用藥量換算，甲連盆腔膠囊組1.48 g/kg，婦科千金膠囊組0.5 g/kg，余組大鼠均用4 mL生理鹽水灌胃。灌胃7天重新稱重，根據體重調整灌胃量，每天灌胃1次，連續14天。

1.3 觀察指標

1.3.1 一般情況觀察

觀察大鼠的精神狀態、飲食、二便及活動情況，觀察皮膚手術切口有無感染、有無意外死亡等。

1.3.2 盆腔大體情況觀察

末次灌胃后禁食禁飲12小時，同前述麻醉開腹，肉眼觀察盆腔臟器形態大小、色澤，有無粘連、積液等情況。

1.3.3 子宮組織學觀察

肉眼觀察完畢后，取下左側子宮組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定，酒精脫水，石蠟包埋，切片，進行蘇木素-伊紅（HE）染色后，光鏡下觀察并拍照。

1.3.4 血清TNF-α、IL-2水平檢測

腹主動脈采血離心（3000 r/min×20 min），取上清液，-20℃冰箱保存備用，采用酶聯免疫吸附測定法（ELISA），遵循試劑盒說明書操作，測定TNF-α、IL-2的水平。

1.4 統計學方法

2 結 果

2.1 一般情況觀察

整個實驗周期大鼠精神狀態好，活動、飲食、二便等無異常，手術切口未見感染。造模過程中麻醉過量死亡2只，用于模型鑒定取材3只，假手術組術后第二天縫線斷裂臟器脫出造成感染死亡1只，模型組采血失敗1只，最終納入分析的大鼠：空白組（n=15），假手術組（n=14），模型組（n=14），婦科千金膠囊組（n=15），甲連盆腔膠囊組（n=15）。

2.2 盆腔大體情況觀察

空白組和假手術組盆腔臟器形態規則對稱，顏色紅潤，無積液及粘連形成；模型組子宮左側與右側相比，明顯充血水腫，質地較硬，管腔狹窄，與周圍組織粘連；治療組（甲連盆腔膠囊組和婦科千金膠囊組）左側子宮組織充血減輕，質地柔軟，與周圍組織無明顯粘連。

2.3 子宮組織形態學觀察

空白組和假手術組表現相似，子宮壁結構清晰，上皮組織及腺體完整，無炎性細胞浸潤，肌纖維排列整齊；模型組子宮壁結構紊亂，上皮細胞增生，明顯變性、壞死區，大量炎性細胞浸潤，周圍結締組織增生明顯；治療組子宮壁組織結構基本清晰，少量炎性細胞浸潤，腺體完整，纖維組織輕度增生。見圖1。

圖1 大鼠子宮組織切片光鏡下圖像（HE，×200）

2.4 血清TNF-α、IL-2水平檢測

與空白組和假手術組比較，模型組血清TNF-α、IL-2水平明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，治療組TNF-α、IL-2水平均顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清IL-2、TNF-α水平比較

表1 各組大鼠血清IL-2、TNF-α水平比較

注：與空白組和假手術組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05

組別 例數（n）TNF-α（pg/mL） IL-2（pg/mL）空白組 15 209.5±31.7 877.3±141.6假手術組 14 217.1±20.9 900.46±126.7模型組 14 334.0±51.51） 1182.7±261.61）婦科千金膠囊組 15 255.7±37.32） 1029.0±161.72）甲連盆腔膠囊組 15 244.7±37.62） 1004.0±158.22）

3 討 論

慢性盆腔炎（CPID），又叫盆腔炎性疾病后遺癥（SPID），是育齡期婦女常見病，多發病，中醫治療方法靈活、干預靶點多重、給藥途徑多樣，且毒副作用較小，從古至今已經積累了豐富的經驗。其具體發病機制尚未完全闡明，諸多研究表明該病的發生發展與機體內炎性細胞因子的異常表達密切相關，持續的的炎性介質活化和滲出會進一步引起組織病理性損傷，損傷修復過度，最終導致廣泛粘連，增生和瘢痕形成等自身免疫性病變，這些病變又反過來加重炎癥反應[3]。血液中炎性因子的改變是機體炎癥的反應，IL-2是趨化因子家族中的一員，具有多向性作用，能介導T、B細胞活化、增殖和分化，維持T細胞穩定，并增強NK細胞的殺傷力[4]，在機體免疫應答和抗感染中有著重要作用。TNF-α主要是由單核巨噬細胞分泌的促炎因子，誘導各種趨化因子和促炎因子的合成釋放，在炎癥初期，可增強機體的抗感染作用，但持續高表達會導致過度免疫反應，出現細胞毒性作用，從而加重炎癥和組織損傷，是腹腔粘連形成的一個重要標志物[5]。

祖國醫學認為CPID的病因歸結于“濕、熱、寒、瘀、虛”，現代研究表明，濕熱是致病的主要因素，瀘州地處川蜀，地域氣候和飲食習慣使當地人更易受內外濕熱邪氣所侵[6]，因此，濕熱瘀結證歷來認為是川蜀地區最常見的證型。四川名中醫莊誠老教授，根據因地制宜原則，結合數十年臨床經驗，創立了甲連盆腔湯，為方便患者服用，我院改良成膠囊制劑，臨床療效滿意。方中銀花、連翹、紫花地丁、蒲公英主以清熱解毒，輔以椿皮除濕止帶，桔梗辛散排膿，鱉甲活血軟堅散結，蒲黃、姜黃活血行氣止痛，諸藥和之，既能祛邪清熱解毒，又能利濕化瘀止痛，寒溫并用，標本兼顧。

本實驗數據表明模型組子宮組織光鏡下可見炎性因子大量浸潤和組織增生，血清IL-2、TNF-α水平升高明顯，藥物干預后，子宮組織形態等到改善且IL-2、TNF-α水平顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05），一來說明CPID模型制備成功，二來說明藥物治療有效。婦科千金膠囊是目前治療盆腔炎性疾病公認的中成藥，特別是慢性盆腔炎，本研究觀察到甲連盆腔膠囊有與之相似甚至更好的抗炎作用，這可能與婦科千金膠囊用藥療程和單獨用藥有關。

甲連盆腔膠囊可能通過降低CPID大鼠體內炎性因子水平，減輕局部炎癥反應，促進受損組織修復，從而達到治療CPID的作用，值得進一步推廣和研究。