FKS 家族基因對釀酒酵母壓力耐性的影響

楊 歌，王金晶，李 佳，鄭飛云，劉春鳳，李永仙，鈕成拓，李 崎*

（1.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 釀酒科學與工程研究室，江蘇無錫 214122）

釀酒酵母與人類的生活息息相關，并被譽為工業上最重要的微生物之一，它在發酵、烘焙、釀造、藥物和化工生產中有著重要的作用，尤其在啤酒行業，釀酒酵母對啤酒的質量起決定性的作用[1-2]。釀酒酵母在發酵過程中受到來自發酵環境和工藝操作的脅迫，酵母細胞需要應對高滲透壓、乙醇的積累和營養物質匱乏等壓力[3-4]，這些壓力可能降低釀酒酵母酵母活性、促進細胞的自溶甚至死亡[5]。釀酒酵母的自溶對啤酒的質量包括啤酒的風味和品質有嚴重的負面影響[6-7]。因此，提高釀酒酵母的壓力耐受性對發酵行業、工業等都存在重大意義。

酵母細胞壁作為保護細胞的第一層屏障，主要的作用是維持內部滲透壓、保護細胞免受機械壓力的破壞以及維持酵母的細胞形態等[8-9]。酵母細胞壁是雙層網狀結構，主要由電子透明的內層和電子不透明的外層構成，幾丁質和β-葡聚糖構成內層物質，甘露聚糖構成外層物質[10-11]。其中β-葡聚糖由1，3-β-葡聚糖（80%～90%）和1，3-β-葡聚糖（10%～20%）構成，是細胞壁結構重要的基礎單元。1，3-β-葡聚糖螺旋結構使細胞壁靈活多變、一定的彈性以及較強的拉伸強度[12]。催化合成1，3-β-葡聚糖最主要的酶是1，3-β-葡聚糖合成酶（1，3-β-glucan synthase，GS）[13]。GS 中兩個相似度為88%的催化亞基是Fks1p、Fksp2 分別由FKS1 和FKS2 催化合成，Fks3p 與Fks1p 有56%的同源性[14-15]。研究人員通過過表達FKS1 基因，發現突變菌株的耐受性和抗自溶能力均高于原始菌株[16]。另有研究報道FKS3 基因敲除菌株所產生的芽孢對溫度、乙醇等的抗性發生改變，Fks3p 會影響芽孢的生殖，但是其作用機制尚不清楚[17-18]。FKS 家族基因對細胞壁的代謝合成及細胞耐受能力有一定協調的作用。

本研究通過同源重組的方法，構建了三株FKS家族基因缺陷菌株，對比了重組菌株和原始菌株環境抗逆性、酵母細胞活性、合成乙醇能力等，為研究釀酒酵母耐受性及選育優良耐受性的釀酒酵母提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 本研究所用質粒及菌株 本研究所用的質粒和菌株如表1 所示。

表1 本研究所用所用質粒和菌株Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 培養基及試劑

1）LB 培養基：氯化鈉10 g/L，酵母提取物5 g/L，胰蛋白胨10 g/L。篩選陽性轉化子時加入Amp 150 μg/mL，固體培養基添加瓊脂量為18～20 g/L。

2）YPD 培養基：葡萄糖20 g/L，酵母提取物10 g/L 胰蛋白胨20 g/L。篩選轉化子時需添加G418 至200 μg/mL，固體培養基添加瓊脂量為18～20 g/L。

3）環境脅迫抗性平板：在YPD 平板上填加無水乙醇至8%濃度、NaCl 至0.4 mol/L 濃度。

4）麥汁培養基：將經過糖化工藝的麥汁過濾后煮沸60～80 min。并添加酒花，添加量為0.3 g/L，酒花分三次加入，剛煮沸時加入1/2，煮沸30 min 添加1/4，煮沸前10 min 添加1/4。

5）檸檬酸鹽緩沖液：檸檬酸10.5 g/L，檸檬酸三鈉14.7 g/L，用1 mol/L 檸檬酸溶液調至pH=4.0。

Amipicillin、IPTG Dioxane Free（IPTG）與Magenta-Gal（X-Gal）購自生工生物（上海）股份有限公司；質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒與膠純化試劑盒均購自美國歐米茄公司；克隆載體pMD 19T-simple、T4DNA 連接酶、感受態細胞制作試劑盒均購自TaKaRa 公司；G418 購自TIANGEN 生化科技有限公司；其他實驗用試劑均購自Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因克隆及質粒的構建 根據pUG6 質粒的序列以及SGD 公布的FKS家族基因序列，引物序列如表2 所示。以pUG6 質粒為模板，表2 所示序列為引物，通過PCR 分別擴增含有KanMX 基因和FKS1、FKS2、FKS3 同源臂的目的基因片段（中斷盒），將PCR 產物回收純化后的與載體pMD 19Tsimple TA 連接得到重組質粒。重組質粒構建流程如圖1 所示，將重組質粒分別轉入大腸桿菌JM109 中保存。

表2 敲除盒擴增引物Table 2 Primers for amplification of disruption cassettes

將得到重組質粒按照醋酸鋰轉化法轉化到原始菌株W303 中，為能達到高效的同源重組，設計引物中兩個核苷酸序列之間同源序列為50 bp 左右[20]。轉化后先涂布到YPD 平板上，在28 ℃條件下，培養至肉眼可見菌菌落，采用平板影印法影印到含有200 μg/mL G418 的平板上，對長出的菌落進行驗證。驗證所需引物如表3 所示。

1.2.2 酵母生長性能分析 將原始菌株和重組菌株活化后以轉接至200 mL YPD 液體培養基中培養中，接種后的菌濃約為106個/mL。28 ℃180 r/min掊養。在此培養過程中每2 h 取一次樣品，吸光光度法測定菌液在560 nm 下的吸光值，并繪制生長曲線。

1.2.3 酵母細胞壁多糖分析 培養收集酵母泥5 g，加入100 mL 醋酸鋰-SDS 溶液（醋酸鋰50 mmol/L，SDS 0.034 mol/L）溶液，在70℃水浴溫育10 min，每隔2.5 min 將三角瓶內的液體搖勻。將提取液在5 000 r/min 下離心10 min，除去菌體碎片。將上清液收集后，用1 倍體積的95%乙醇在4℃沉淀多糖[21]。加入75 μL 72%（w：v）濃硫酸，20～25 ℃放置3 h，中間間隔一定時間混合體系。3 h 后，加入950 μL 純水稀釋濃硫酸至1 mol/L 硫酸，準確沸水浴4 h。反應結束后，滴加飽和Ba（OH）2至中性，4 ℃靜止過夜，第2 天測定溶液pH 在6～9 之間可進行下一步反應。離心去除沉淀，調整體積至20 mL[21]。將細胞壁酸解液稀釋至適合濃度，經0.45 μm 濾膜過濾后上高效離子色譜進行分離檢測。

圖1 重組質粒構建示意圖Fig.1 Construction of the recombinant plasmid

表3 重組菌驗證引物Table 3 Primers for verified transformants

1.2.4 酵母抗脅迫能力分析 抗性平板分析：對原始菌株和重組菌株的各項耐壓性能的評價是根據菌體在不同壓力YPD 平板上的生長情況。將菌種活化后，取5 mL 菌液轉移到30 mL YPD 培養基中，饑餓培養則接入相同體積的無菌水中培養6 h。收集菌體并用無菌水洗滌兩次，用血球計數板鏡檢計數，根據稀釋倍數比例，調節菌體濃度為107個/mL，10 倍梯度稀釋，依次取3.5 μL 菌液點種在含有8%（v/v）乙醇、0.4 mol/L NaCl 的抗性平板上，培養2～3 d，觀察生長情況。

1.2.5 液體發酵抗性分析 在斜面上取一環菌接種于10 mL 麥汁培養基中，活化36 h，在9 mL 麥汁試管接入1 mL 菌液，活化48 h，將全部菌液接入70 mL三角瓶中于培養48 h，所有活化溫度都為28 ℃。離心收集酵母泥，按照0.5%（w/v）的比例接入300 mL厭氧瓶中于28 ℃下發酵，在發酵第3，7 d 和12 d分別取樣。

1）測定酵母死亡率，取得的樣品與亞甲基紫染色液混合，染色5 min，將混合液滴在血球計數板上鏡檢計數。紅色為死亡細胞，無色為活細胞，計數并計算酵母死亡率。酵母死亡率計算公式如下

2）將收集的發酵液離心收集菌體，2.5%的戊二醛固定后，用掃描電鏡（SEM）進行細胞顯微學在6 000 的倍數下觀察細胞形太。

3）發酵結束后，測定發酵液酒精度。

2 結果與分析

2.1 FKS1、FKS2 和FKS3 基因缺失型菌株的構建

將該基因中斷盒轉化入原始菌株W303，通過同源重組法用KanMX 替換FKS1 基因，從而敲除FKS1 基因。將得到的轉化子提取基因組，進行PCR驗證，結果如圖2 所示，圖2（a）設計引物是FKS1 基因上游同源臂和KanMX 之間的序列，擴增的是陽性結果為1 213 bp；圖2（b）設計引物是擴增FKS1基因上下游同源臂之間的序列。重組菌PCR 結果為2 100 bp，原始菌株結果為5 844 bp，不添加模板結果為空白，驗證結果符合理論值，構建的重組菌命名為fks1-QT。

圖2 P CR 驗證重組菌中fks1-QT 中FKS1 基因敲除Fig.2 PCR verification of the FKS1 knocked-out in fks1-QT strain

同樣的分子操作構建FKS2 和FKS3 缺陷型菌株。FKS2 和FKS3 缺陷菌株的基因組分別DNA 用F2-UF/F2-UR、F2-DF/F2-DR 和F3-UF/F3-UR、F3-DF/F3-DR 引物對進行PCR 驗證，結果如圖3和圖4 所示，驗證結果符合理論值，將重組菌株命名為fks2-QT 和fks3-QT。

圖3 P CR 驗證重組菌中fks2-QT 中FKS2 基因敲除Fig.3 PCR verification of the FKS2 knocked-out in fks2-QT strain

圖4 P CR 驗證重組菌中fks3-QT 中FKS3 基因敲除Fig.4 PCR verification of the FKS3 knocked-out in fks3-QT strain

2.2 重組菌生長性能分析

酵母的生長活性對酵母的工業應用有重要作用，圖5 所示為各重組菌株與原始菌的生長曲線，由圖5 可知，重組菌株fks2-QT 和fks3-QT 的生長速度和原始菌株W303 差異不大，而重組菌種fks1-QT 的生長速度始終慢于原始菌株。FKS1 基因是合成細胞壁葡聚糖酶的關鍵基因，敲除FKS1 基因的菌株合成酵母細胞壁葡聚糖的能力減弱，酵母細胞壁的正常代謝功能受到影響，從而影響酵母的生長。FKS2 基因對合成細胞壁葡聚糖有一定影響較小，FKS2 基因的缺失并沒有影響酵母細胞的生長。FKS3 對酵母細胞的生長并無太大影響。因此，FKS1基因對維持酵母細胞活性有一定作用，FKS1 基因的缺陷導致細胞的生長速度減緩，FKS2、FKS3 基因對酵母的生長率沒有明顯的影響作用。

圖5 重組菌株和原始菌株的生長曲線Fig.5 Growth curves of the recombination strains and wild type strain

2.3 不同菌株細胞壁多糖含量的分析

重組菌株和原始菌株酵母細胞壁多糖的含量如圖6 所示，重組菌株fks1-QT（1.77±0.11）mg/g，3-β-葡聚糖的含量相對于原始菌株W303（3.44±0.097）mg/g 降低了約60%。重組菌 株fks2-QT（2.76±0.13）mg/g 和fks3-QT（3.10±0.15）mg/g 的1，3-β-葡聚糖的含量相對于原始菌株W303 分別降低了19.5%和3.8%，變化程度不大。FKS1 基因的缺失導致酵母菌株細胞壁1，3-β-葡聚糖的含量大幅度降低。FKS2 基因缺失導致酵母菌株細胞壁1，3-β-葡聚糖的含量明顯降低，FKS2 基因對和細胞壁葡聚有影響但作用不大。FKS3 基因缺失對酵母菌株細胞壁1，3-β-葡聚糖的含量并無太大影響。

重組菌株fks1-QT 細胞壁中甘露聚糖的含量為（3.42±0.10）mg/g，相對于原始菌株W303（2.81±0.09）mg/g 增加了17.8%，重組菌株fks2-QT 和fks3-QT 細胞壁甘露聚糖的含量相對W303 有一定程度減少。重組菌株fks1-QT（0.28±0.04）mg/g 細胞壁中幾丁質相對于原始菌株W303（0.12±0.03）mg/g增加了57.1%，重組菌株fks2-QT 和fks3-QT 細胞壁幾丁質的含量相對W303 沒有太大變化。突變菌株細胞壁中1，3-β-葡聚糖的含量都有不同程度的降低，酵母細胞壁成分是動態的，為了維持細胞壁完整性，其他多糖會隨之產生變化。

圖6 細胞壁多糖含量Fig.6 Content of polysaccharides in cell wall

2.4 抗環境脅迫能力分析

酵母菌株在工業應用中要面對發酵液中環境的壓力，是反映酵母性能的重要指標。原始菌株和重組菌株對滲透壓、酒精濃度以及對饑餓的抗性如圖7 所示：在含有0.5 NaCl mg/g 及饑餓培養條件下，原始菌株W303 的生長優勢最明顯，而重組菌株fks1-QT 的生長性能最差，而在在10%乙醇的環境壓力下，原始菌株W303 的抗性最差。酵母細胞壁有抵抗外界滲透壓的作用，細胞1，3-β-葡聚糖的含量減少，導致酵母細胞細胞壁抵抗外界滲透壓能力變弱，突變菌株在在含有0.5 NaCl mg/g 的條件下生產性能較差。細胞壁1，3-β-葡聚糖的含量減少導致突變菌尤其是FKS1 基因缺失菌株對環境適應能力變弱，在饑餓培養條件下生長狀況較差。在10%乙醇環境壓力下，原始菌株的生長狀況較差。該結論可以證明，FKS 家族基因對細胞抗滲透壓和饑餓的能力有重要作用，而對抗酒精脅迫的能力有負面影響。

2.5 酵母液體發酵實驗

圖7 不同菌株在抗性平板上的生長狀況Fig.7 Different strains growth condition in stressful environment

為判斷不同菌株在啤酒發酵條件下的狀況，將菌株置于麥汁培養基中發酵，模擬發酵環境。分別于第2、7 和12 天取發酵液，測定酵母死亡率，并掃描電鏡觀察酵母的形態（圖8）。如表4 所示，第2 天不同菌株的死亡率差異不大，酵母細胞的形態都是飽滿、圓潤、沒有破損的，隨著時間的推移不同菌株酵母的死亡率差異越大。第12 天時，fks1-QT 菌株的死亡率最高，觀察SEM 圖片，細胞出現較大范圍的自溶狀況，細胞內容物流出，嚴重干癟變形。fks2-QT 菌株的死亡率與原始菌株W303 接近，且與原始菌株W303 相同部分酵母開始有破損，小范圍的酵母出現自溶狀況。重組菌株fks3-QT 的死亡率低，并且低于原始菌株W303 的死亡率，細胞依舊圓潤，比較完整，良好的抵抗外界壓力。由此證明，FKS1 基因通過控制對細胞壁的完整性對抵抗發酵環境的壓力有重要的作用，FKS3 基因對細胞抵抗發酵環境的壓力作用有負面作用。

表4 細胞在發酵液中的死亡率Table 4 Mortality rate of yeast cells in the fermentation broth

圖8 原始菌株和重組菌株的掃描電鏡（SEM）分析Fig.8 SEM analysis of wild type strain and mutant strains

2.6 FKS 家族基因對酵母合成乙醇能力的影響

模式菌株W303 不具備工業酵母良好的發酵性能，但有完整的合成乙醇的途徑，測定重組菌株和原始菌株的酒精度，可反映FKS 家族基因對酵母細胞合成乙醇的影響，對工業酵母有一定的指導意義。經過15 d 的發酵后測定發酵液的酒精度（圖9），重組菌株fks3-QT（1.53±0.031）%的酒精度最高，之后依次為W303（1.23±0.032）%、fks2-QT（0.85±0.031）%、fks1-QT（0.485±0.031）%。根據2.5節的分析FKS 家族基因對酵母的活性、對外界環境的耐壓性有不同的影響，抗發酵環境壓力強的菌株fks3-QT 活性更強導致發酵合成的乙醇濃度最高，抗發酵環境壓力較弱的菌株fks1-QT 活性更弱導致發酵合成的乙醇濃度最低。因此，FKS 家族基因通過影響酵母在發酵時的細胞狀態，從而影響酵母合成乙醇的能力。

圖9 不同菌株發酵酒精度Fig.9 Fermentation liquid alcohol of different strains

3 結語

酵母抵抗外界環境的壓力對酵母在發酵工業中，尤其是啤酒行業的生產起著關鍵的作用。了解酵母抗壓力機制，對選育強壯的酵母有重要的指導作用。酵母也常被用來作為模式生物研究真核細胞的遺傳學和生理學，但是多倍體酵母中，多位基因存在時在基因改良過程中有可能發生回復突變[23]，單倍體W303 模式菌株則可以避免這些問題。

本研究運用生物學手段得到FKS 家族基因單個敲除的重組菌株，比較原始菌株和重組菌種的生長狀況、細胞壁多糖含量、抗脅迫能力以及在發酵環境下的死亡率等。發現重組菌株fks1-QT 細胞壁1，3-β-葡聚糖相對于原始菌株W303 的含量降低了60%，且生長性能較差，但抗酒精脅迫抗性更強，而滲透壓和饑餓耐受性較差，在發酵環境中也更容易死亡。重組菌種fks2-QT 細胞壁中β-葡聚糖的含量略低于原始菌株W303，其他生理形狀與原始菌株相差不大。重組菌株fks3-QT 在發酵環境中的死亡率低于原始菌株，SEM 電鏡中fks3-QT 的狀態、酒精代謝活性也優于原始菌株，因此FKS1 基因對酵母維持細胞耐受性、保證細胞正常生長有重要的作用，而FKS3 基因對酵母耐受性有負面作用，但其作用機理仍待研究。