二酪氨酸層賦予酵母孢子抗氧化活性

MUKAMA Omar，LEO Bemena，王曉文，高曉冬，中西秀樹

（江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

釀酒酵母的產孢過程是在碳源以及氮源匱乏等饑餓條件下引起的一個連續的過程。在此過程中，釀酒酵母營養細胞的細胞膜轉化為孢子膜[1]，最終在二倍體細胞中形成四個單倍體孢子。孢子壁由四層結構組成，從內到外依次為：甘露糖層、葡聚糖層、殼聚糖層和二酪氨酸層。相較于營養細胞，孢子可以有效抵抗外界的惡劣環境，該特性主要是由于殼聚糖層和二酪氨酸層的保護作用。孢子壁結構是由內到外依次合成，在殼聚糖層形成后，二酪氨酸層才開始合成[2]。二酪氨酸層主要是由酵母細胞質中兩個L-酪氨酸交聯形成的二肽（LL-二甲?；?N，N’-二酪氨酸）為主體的結構，該形成過程分為兩步：L-酪氨酸的N-甲?；约癓-甲酰酪氨酸的二聚化[3]。這兩個步驟分別由Dit1 和Dit2 兩個蛋白調控完成[4]。隨后，LL-二甲?；?N，N’-二酪氨酸分子通過包括Dtr1 在內的多個轉運蛋白協助下，運送到形成過程中的孢子壁上[5]，且二酪氨酸層的組裝機制目前尚不清楚。

氧化劑可以通過自由基的介導來催化反應，其氧化性會對生物大分子（核酸，蛋白質，糖類和脂類）造成傷害，因此，氧化劑在生物體內有很大的危害。H2O2作為氧化劑，進入細胞后，主要通過抑制ATP 的合成（GAPDH 失活）影響糖酵解途徑，并且通過引起氧化應激影響線粒體的氧化磷酸化途徑[6]。在過渡金屬存在時，即使低濃度的H2O2（20～80 μmol/L）也可以影響煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的活性，NAD+對于DNA 修復酶（多-ADP 核糖聚合酶）的活性是十分重要的。羥基自由基會造成不可逆的DNA 鏈斷裂[2，7]，以及堿基的羥基化。因此，氧化劑最終會造成細胞的損傷或者死亡。酚類化合物可以通過抑制自由基（如H2O2）與金屬離子（如Fe2+）的螯合從而抑制氧化性。在該機制中，自由基奪走酚基的一個氫原子，而酚基可以從抗氧化劑上得到一個電子轉變為自由基陽離子[8]。酵母孢子的二酪氨酸是一種酚類化合物.過去的研究顯示，相較于營養細胞，酵母孢子對消化酶、乙醚處理、部分有機溶劑及高溫等特殊條件具有抵抗能力[9]。本研究目的是研究孢子對外源活性氧的抵抗能力，以及通過釀酒酵母營養細胞合成NN′-二NN′甲酰基二酪氨酸并研究-二甲?；野彼岬目寡趸匦?。

1 材料與方法

1.1 菌株與生長條件

除了另外標注的技術外，本文所提到的基因操作參考文獻[10]。所用到的酵母菌株見表1，引物序列表2。

在克隆過程中，大腸桿菌在加入氨芐青霉素（100 μL/mL）的LB 培養基（1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%NaCl）中培養。酵母營養細胞是在YPAD（1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，0.033%腺嘌呤）和/或去除某一或某幾種特殊氨基酸的氨基酸混合物的完全培養基（營養缺陷型選擇培養基）中培養。酵母產孢細胞的培養是在YPACe 培養基（1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%乙酸鉀）。

為了敲除DIT1，以pFA6a-HIS3MX6[11]為模板，以BLD1 和BLD2 為引物，通過PCR 技術擴增得到一條DNA 片段，將該片段分別融合進單倍體AN117-4B 和AN117-16D，然后將二者融合，得到dit1△二倍體菌株。

表1 本實驗所用到的釀酒酵母菌株Table 1 S.cerevisiae strains used in this study

表2 本實驗所用的引物Table 2 Primers used in this study

1.2 質粒

本文所用的質粒見表3。pRS424-GAL-DIT1，pRS426-GAL-DIT2 and pRS424-TEF-DTR1 三個質粒是按如下方法構建的。

首先，DIT1，DIT2 和DTR1三個基因是以AN120 酵母菌株的基因組DNA 為模板[12]分別用引物 HXO599 和 HXO600，HXO601 和 HXO602，HXO603 和HXO604 通過PCR 擴增的。得到的擴增片段用SpeI 和XhoI 進行切割，然后將其連接到以同樣酶切位點切割的質粒pRS424-GAL，pRS426-GAL 或pRS425-TEF。用醋酸鋰轉化法將目的質粒轉化到酵母YH499 菌株中進行表達[16]。所有構建的質粒均由基因測序確認（BGI，China，Beijing）。

表3 本實驗所用到的質粒Table 3 Plasmids used in this study

1.3 酵母產孢

取單菌落在5 mL 的YPAD 中培養過夜，然后將1 mL 菌液轉接到200 mL 的YPA 培養基中培養24 h。離心（5 600 g，30 s）收集細胞，并用去離子水洗，然后將其轉移到2%的醋酸鉀培養24 h。產孢后，離心（5 600 g，30 s）收集孢子，并用6 mol/L NaCl 溶液洗滌2 次。

1.4 點板實驗

氧化劑的處理實驗是根據文獻[17]稍作調整后進行的。當細胞生長到穩定期后，收集菌體處理到105cells/mL，用1 μL 的氧化劑（2 mmol/L FeSO4/2 mmol/L H2O2或者2 mmol/L FeCl3/2 mmol/L H2O2）處理?；旌弦涸?0 ℃培養1 h，依次按梯度稀釋10 倍后震蕩混勻后分別取5 μL 點板到YPAD 培養基上，重復上述實驗一次。同樣的細胞用去離子水稀釋100 倍，分別涂于兩塊相同的平板上，對生長的菌落計數，取兩板的平均值。實驗圖片是用Image Quant LAS 4 000（GE Healthcare，USA）拍攝的。

1.5 LL-二甲酰基-N，N′-二酪氨酸生物合成

含有空載（對照）和質粒pRS424-GAL-DIT1，pRS426 -GAL -DIT2 和 pRS424 -TEF -DTR1 的YPH499 單菌落在含2%葡萄糖的SD 培養基上培養到指數期，離心（8 560 g，2 min）收集菌體，去離子水洗2 次，然后轉入含有2%半乳糖的SD 培養基上培養48 h。培養后含有LL-二甲酰基-N，N′-二酪氨酸的培養基（4 mg/mL）將用于下一步的實驗。

1.6 LL-二酪氨酸和LL-二甲酰基-N，N′-二酪氨酸的化學合成

LL-二酪氨酸和LL-二甲?；?N，N′-二酪氨酸通過[18]所描述的用L-酪氨酸或者N-甲酰基-L-酪氨酸（Sigma-Aldrich）進行氧化反應從而合成。反應過程如下：2 mL 的Tris-HCl（0.3 mmol/L，pH 8.5），1.5 mL 的L-tyrosine 或者N-甲?；?L-酪氨酸（2 mg/mL），0.1 mL 的過氧化氫（8.82×10-5mol/L），0.5 mL 的過氧化物酶（1 mg/mL，Sangon，Shanghai，China），混合，20 ℃培養1 h。然后進行LC-MS 分析，確認LL-二酪氨酸和LL-二甲?；?N，N′-二酪氨酸是否合成。

1.7 二酪氨酸的高效液相色譜（HPLC）分析

該樣品是用Discovery C18 柱（150 mm×4.6 mm ID，5 μm particles）（Sigma Aldrich，U.S.A）在Waters分離模塊e2695 HPLCs 系統（Wexford，UK）進行分析。每組加入10 μL 樣品。柱子經過含有100%CH3CN 的0.01 M 三氟乙酸梯度洗脫（0～50%的CH3CN，55 min。樣品流速為1 mL/min，紫外熒光檢測條件為：激發波長285 nm，發射波長425 nm。

1.8 抗氧化劑實驗

DPPH 和ABTS 溶液被用來檢測二甲酰基-二酪氨酸的自由基清除能力。DPPH 的用法是根據[19-20]中所描述的方法進行的。在99%甲醇溶液中，加入3.5 mL 的60 mol/L 的DPPH，然后分別加入10，20，50 μL 的含有培養基的LL-二甲酰基-N，N′-二酪氨酸，空質粒，單獨的培養基和合成的LL-二甲酰基-N，N′-二酪氨酸?；旌先芤涸诤诎抵惺覝嘏囵B20 min，然后在517 nm（吸光度）下用Ultrospec 2100 pro UV/Visible Spectrophotometer（GE healthcare，Fairfield，USA）讀數。清除力的計算如下：

ABTS 工作溶液的制備過程是按照[21-22]中的描述。本實驗中，在99%甲醇溶液中，加入3.5 mL 的60 mol/L 的ABTS，然后分別加入10，20，50 μL 的含有培養基的LL-二甲酰基-N，N′-二酪氨酸，空質粒，單獨的培養基和合成的LL-二甲?；?N，N′-二酪氨酸。混合溶液在黑暗中室溫培養16 h，然后在734 nm（吸光度）下用Ultrospec 2100 pro UV/Visible Spectrophotometer（GE healthcare，Fairfield，USA）讀數。

1.9 統計學分析

本研究至少做了3 次的獨立實驗，如±SE 所顯示的。

2 結果與討論

2.1 孢子的抗氧化性相對于營養細胞更強

為了測試孢子是否具有抗氧化能力，將營養細胞和孢子分別用2 mmol/L FeCl3/2 mmol/L H2O2或2 mmol/L FeSO4/2 mmol/L H2O2處理。通過氧化反應，FeCl3可以與H2O2反應并產生帶超氧陰離子。Fe2+與H2O2反應產生羥基自由基。將細胞在該溶液中培養1 h 后在YPAD 上點板。如圖1 所示，用FeCl3/H2O2或FeSO4/H2O2處理的孢子與未處理的孢子生長狀況相似。然而，處理后的營養細胞的生存力顯著降低。這些結果表明，與營養細胞相比，孢子具有抗氧化能力。

圖1 營養細胞和孢子對氧化應激的敏感性Fig.1 Susceptibility of vegetative cells and spores toward oxidative stress

2.2 二酪氨酸層賦予孢子抗氧化能力

本研究評估了二酪氨酸層是否具有抗氧化性。由于DIT1 基因控制合成二酪氨酸，其突變導致二酪氨酸層缺失。如圖2（a）所示，dit1△突變株孢子對FeCl3/H2O2和FeSO4/H2O2比野生型孢子更敏感。

如圖2（b）所示，經FeCl3/H2O2處理后，dit1△的孢子，野生型孢子和營養細胞的存活率分別降低到28.55%，60%和0，經過FeSO4/H2O2處理，dit1△的孢子，野生型孢子和營養細胞的存活率分別降低到37.43%，90.84%和0。該結果表面二酪氨酸層賦予孢子抗氧化的能力。

2.3 二甲酰基二酪氨酸能夠分泌到培養基中

二酪氨酸層主要由二甲?；野彼峤M成。本研究檢測了二甲酰基二酪氨酸是否顯示出抗氧化活性。為了獲得大量的二甲酰基二酪氨酸，本研究采用生物法合成二甲?；野彼?。

圖2 二酪氨酸層的缺失對細胞抗氧化性的影響Fig.2 Effect of the loss of the dityrosine layer on oxidative stress resistance

之前研究表明，即使在增殖期營養細胞中，二甲酰基二酪氨酸也可由DIT1，DIT2 和DTR1 三個基因控制合成的[3-5]。因此，分別構建了在GAL1 啟動子下游含有DIT1，DIT2 及DTR1的質粒。在GAL1 啟動子調控下，在含有葡萄糖的培養基中抑制基因表達，并通過含半乳糖的培養基來誘導基因表達。

轉化構建得到的3 種質粒到酵母菌株YPH499中，挑取單個轉化子在含有葡萄糖或半乳糖的培養基中培養48 h。離心除去細胞并將培養基濃縮10倍。二酪氨酸是一種熒光分子：激發波長為380 nm，發射波長為475 nm。在半乳糖培養基中，檢測到強烈的二酪氨酸熒光信號。在葡萄糖培養基中，未檢測到強烈的熒光信號。表達了空載體的培養基中，未檢測到熒光信號。

為了進一步驗證培養了表達Dit1，Dit2 和Dtr1細胞的培養基中含有二甲酰二酪氨酸，本實驗進行了HPLC 驗證。在表達Dit1，Dit2 和Dtr1 細胞用過的培養基中檢測到二甲酰基二酪氨酸峰，但在含有空載體的細胞的培養基中沒有檢測到（圖3）因此，實驗用過的培養基中含有二甲?；野彼帷?/p>

圖3 在表達DIT1，DIT2 和DTR1 細胞用過的培養基中檢測二甲?；野彼酕ig.3 Detection of bisformyl dityrosine in spent media cultured DIT1，DIT2，and DTR1 expressing cells

2.4 二甲?；野彼峋哂锌寡趸钚?/h3>

通過使用DPPH 和ABTS 測定，本研究檢測了二甲?；野彼崾欠窬哂锌寡趸钚浴Ｈ鐖D4 所示，兩種方法測定顯示含二甲酰基二酪氨酸的培養基具有抗氧化活性，而在表達了空載體的細胞培養基中沒有觀察到這種活性。

圖4 二甲基二酪氨酸的抗氧化活性Fig.4 Antioxidant activity of bisformyl dityrosine

3 結語

孢子具有對外界環境的抵抗能力。本研究證實了孢子的抗氧化性比營養細胞更強。由于二酪氨酸層的存在，孢子展示出了部分的抗氧化性。根據實驗結果，可證實二甲?；野彼釋娧趸瘎┯星宄芰Γ虼司哂锌寡趸钚浴Ｔ卺劸平湍钢挟愒幢磉_DIT1，DIT2 和DTR1 可證實二甲?；野彼釙置诘脚囵B基中，也可被用作抗氧化劑。因此，二甲?；野彼岬纳a十分便捷。二甲?；野彼岷玩咦游磥砜梢员挥米飨嚓P的抗氧化材料。