Bacillus flexus β-淀粉酶低pH 值突變體的構建及在麥芽糖制備中的應用

亓旭輝，吳 敬，王 蕾，陳 晟*

（1.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

β-淀粉酶（β-amylase）又名麥芽糖苷酶、糖原淀粉酶，系統名為α-1，4-葡聚糖-4-麥芽糖水解酶（α-1，4-Dglucan maltohydrolase，EC 3.2.1.2）。β-淀粉酶作用于淀粉時，能夠從其非還原性末端依次切下麥芽糖，獲得的產物為：β-麥芽糖、β-極限糊精及非常少量的β-葡萄糖[1]。因此β-淀粉酶廣泛應用于食品加工、釀造、淀粉糖制備以及醫藥等工業生產領域，還可通過與其他淀粉水解酶如普魯蘭酶、麥芽糖淀粉酶等復配，應用于高純度麥芽糖漿的生產。

β-淀粉酶首先被發現存在于高等植物中，如大豆，麥芽，大麥，馬鈴薯，玉米等[2]。目前商品化的β-淀粉酶主要來源于大麥、大豆、甘薯等糧食作物。由于植物提取β-淀粉酶存在糧食消耗量大、純度較低、質量不穩定、廢水量大等缺點，利用微生物發酵生產β-淀粉酶已成為研究熱點。文獻[3]率先從巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）中發現了細菌β-淀粉酶后，陸續又有多種產β-淀粉酶的微生物菌株被發現，包括蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）[4-5]，多粘芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）[2]，環狀芽孢桿菌（Bacillus circulans）[6]、熱硫梭菌（Clostridium thermosulfurogenes）[7]等。與植物β-淀粉酶相比，微生物來源的β-淀粉酶具有生產工藝簡單、不受原料限制、質量穩定、純度高、能水解生淀粉等優勢，同時也更容易實現大規模、連續化的生產[8]。

但是目前已報道的微生物β-淀粉酶最適作用pH 多為6.0～8.0，這一pH 作用范圍與常用的商品化普魯蘭酶、麥芽糖淀粉酶等其他淀粉水解酶作用的最適pH 4.5～5.5 存在著很大的差距，難以適用于麥芽糖漿的工業生產[9-10]。本研究前期從土壤中篩選得到一株產β-淀粉酶的彎曲芽孢桿菌（Bacillus flexus），并將β-淀粉酶基因克隆，構建了重組表達β-淀粉酶的短小芽孢桿菌。前期研究中發現此重組β-淀粉酶具有比活高，催化效果理想，表達量高的特點。但是此重組酶最適pH 為7.0，這一pH 條件并不適用于工業應用，因此本研究將對其進行定點突變以降低其作用的最適pH 值。突變結束后選取取得預期改變的突變體，進一步探究其在制備麥芽糖漿中的應用效果。以馬鈴薯淀粉為底物，α-淀粉酶進行液化之后，用β-淀粉酶與普魯蘭酶復配生產麥芽糖，并對β-淀粉酶的加酶量進行優化，以在獲得高效生產麥芽糖漿的工藝的同時，降低其生產成本。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒

用于重組質粒構建的克隆宿主E.coli JM109購于寶生物工程有限公司；表達宿主Bacillus choshinensis，帶有源自于B.flexus β-淀粉酶基因β-amy 的重組短小芽孢桿菌B.choshinensis/pNCMO2/β-amy 為本實驗室保藏。

1.2 培養基

LB 培養基：蛋白胨10，氯化鈉10，酵母粉5 g/L。

TM 培養基：多聚蛋白胨10，牛肉粉10，酵母粉10，FeSO4·7H2O 1.0，MnSO4·4H2O 1.0，ZnSO4·7H2O 0.5，CaCl22.0，葡萄糖（單獨滅菌）10 g/L。

1.3 酶和試劑

試劑：DNA 聚合酶以及限制性內切酶購自于寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖、核酸電泳分子量標準品以及其他配套產品購自于上?？魄缟锛夹g有限公司；瓊脂糖凝膠回收、PCR 純化以及質粒小提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；氨芐霉素（Amp）和新霉素（Neo）購自于生工生物工程（上海）股份有限公司；聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）試劑盒購自于碧云天生物技術（上海）有限公司。高溫酸性α-淀粉酶、普魯蘭酶購自于諾維信公司；麥芽糖購自阿拉丁試劑有限公司。其他試劑（除特殊說明外）均購自于國藥集團化學試劑有限公司。

1.4 突變體引物的設計及載體的構建

基于蛋白質結構來選擇突變位點，以質粒pNCMO2-β-amy 為模板，設計PCR 引物（表1），采用一步PCR 法對β-淀粉酶基因進行定點突變。

表1 β-淀粉酶定點突變用引物Table 1 Primers used for site-directed mutagenesis of βamylase

表1 中帶有下劃線的堿基為突變位點。PCR 反應體系（50 μL）：ddH2O 34.3 μL，5×PS Buffer 10 μL，dNTP mixture 4 μL，質粒DNA 模板0.2 μL，上下游引物各0.5 μL，PrimerStar?HS DNA聚合酶0.5 μL。PCR 程序如下：94 ℃預變性4 min，94 ℃，10 s；55 ℃，10 s；72 ℃，7 min 40 s；72 ℃延伸10 min；最后4 ℃保溫。

將經過Dpn I 處理的PCR 產物轉化至E.coli JM109 中并涂布到含30 μg/mL Amp 的LB 固體瓊脂平板上。置于37 ℃的條件下培養約8～10 h。從中挑取乳白色、邊緣光滑的單克隆體，接種到含有30 μg/mL Amp 的LB 培養基中，并置于37 ℃搖床中培養8～10 h 后抽提質粒。將獲得的突變質粒進行雙酶切驗證，驗證正確后進一步送往上海生工生物有限公司進行測序驗證。將測序驗證正確的突變質粒通過電轉轉化至表達宿主B.choshinensis 中，從而得到含有突變基因的重組基因工程菌。

1.5 突變體的表達、純化及SDS-PAGE 電泳分析

驗證正確的突變菌株以1∶1 的比例保存在30%的甘油管中，置于-80 ℃超低溫冰箱中保存備用。使用時取10 μL 轉接到含有10 μg/mL Neo 的10 mL TM 培養基中，37 ℃培養10～12 h，然后以5%的接種量轉接到含有10 μg/mL Neo 的50 mL TM 培養基中，30 ℃繼續搖瓶發酵48 h。發酵結束后離心取上清，即可獲得重組β-淀粉酶的粗酶液。

利用凝膠柱Superdex 200 10/300 GL 進行突變體蛋白的分離純化，這一過程是通過雜蛋白與目的蛋白的大小不同而進行的分離純化，純化后的突變體蛋白將用于進一步的酶學性質分析。

對粗酶液和純化后的蛋白分別進行SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，蛋白電泳膠制備及后續詳細步驟參考碧云天蛋白電泳試劑盒的說明來進行。

1.6 β-淀粉酶活力的測定

用pH 5.5 的Na2HPO4-C4H2O7緩沖液（0.05 mmol/L）配制2%的可溶性淀粉溶液作為反應底物。分別吸取500 μL 底物和400 μL 緩沖液加入到潔凈的15 mL 具塞試管中，置于60 ℃水浴鍋中進行預熱，10 min 后加入100 μL 稀釋后的酶液并混勻，反應10 min 后加入800 μL DNS 終止反應，沸水浴5 min 顯色并定容到15 mL，在540 nm 波長下測量吸光值。使用沸水中滅活的酶液做空白對照。

酶活單位定義：在上述條件下，每分鐘產生1 μmol 麥芽糖所需要的酶量定義為一個酶活力單位[2]。

1.7 突變體的酶學性質分析

對突變體酶的最適作用pH 和作用溫度分別進行探究已驗證突變效果。將酶液分別用pH 3～8 的Na2HPO4-C4H2O7緩沖液（0.05 mmol/L）進行稀釋。以2%可溶性淀粉作為底物，在50 ℃水浴鍋中分別測定突變體在不同pH 下的酶活，將最高酶活力定義為100%，計算突變體在不同pH 下的相對酶活。

以2%可溶性淀粉為底物，控制反應體系pH 值為突變體各自最適pH 值，并在30～70 ℃溫度范圍內設立不同梯度分別測定重組β-淀粉酶酶活，以確定各突變體最適反應溫度。定義最高酶活力為100%，計算不同溫度下的測得的相對酶活。

1.8 突變體的應用

1.8.1 突變體和野生型的應用對比及優化 配制濃度為10%（w/v）的馬鈴薯淀粉溶液，以12 U/g 底物的量加入α-淀粉酶進行液化，保持淀粉溶液溫度90 ℃左右，快速攪拌5～6 min，至淀粉溶液完全澄清。液化結束后用氫氧化鈉和稀鹽酸調節液化液pH 至5.5，分裝至具塞三角瓶中，然后分別加入一定量的普魯蘭酶和β-淀粉酶，這一過程中注意對液化液的保溫以防止其老化。將具塞三角瓶置于60℃水浴搖床中，150 r/min 反應24 h。反應結束后煮沸樣品以終止反應，按1∶1 的比例加入乙腈，靜置1～2 h 使長鏈糖沉淀，離心取上清，產物用HPLC 進行檢測。

1.8.2 淀粉水解產物測定方法 β-淀粉酶水解淀粉的產物主要是麥芽糖，同時含有葡萄糖以及麥芽三糖等副產物，各種產物含量采用HPLC 檢測[11]。色譜條件為：安捷倫1260 HPLC 色譜儀，安捷倫自動進樣器，色譜柱Agilent ZORBAX NH2（4.6×250 mm），示差檢測器為安捷倫G1362A；流動相采用68%（v/v）乙腈和蒸餾水的混合溶液，流速設定為0.8 mL/min，柱溫設為35 ℃。

1.8.3 麥芽糖轉化率的計算

式中：Y 為麥芽糖轉化率，%；M 為產物中麥芽糖的質量，g；S為底物淀粉的質量，g。

2 結果與討論

2.1 突變體的構建

利用在線同源模擬網站SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）對重組β-淀粉酶進行結構模擬，選取晶體結構已被解析并且氨基酸序列相似度最高的β-淀粉酶為模板進行模擬。同源搜索比對發現來自B.cereus 的β-淀粉酶（BCB）（PDB 登錄號：1VEO.1.A）的氨基酸序列同源性較高（72.04%），因此選取BCB 作為模板酶進行同源建模，模擬結構和模版QMEAN 為-0.81[12]。根據重組B.cereus β-淀粉酶三級結構確定其Domain A 或Domain A 和Domain B 之間交界的狹縫及功能域Domain B 內的Loop 區。在此基礎上根據序列信息及三級結構比對結果，找到B.flexus 的β-淀粉酶位于淀粉酶Domain A 以及Domain A 和Domain B 之間交界的催化槽及催化關鍵氨基酸：作為親核試劑的E367及作為酸堿試劑的E172[13]。根據序列及空間結構信息比對圍繞在親核試劑的E367 周圍氨基酸性質如帶電荷、側鏈基團大小、與其他氨基酸形成氫鍵的數量等進行分析，選定擬突變的氨基酸位點以及突變成的目標氨基酸。通常在糖苷酶的作為親核試劑的催化關鍵氨基酸附近引入堿性氨基酸通常可降低反應的最適pH[14-15]。選定47、164 和396 號位進行定點突變，引入堿性氨基酸K，以期獲得最適pH降低的突變體。

以B.choshinensis/pNCMO2/β-amy 質粒為模板經過PCR 獲得含突變位點的目的片段，轉化E.coli JM109，抗性篩選后得到陽性轉化子，并測序驗證，突變正確的質粒通過電轉轉入B.choshinensis感受態細胞，驗證成功后即得目標突變體，突變體在甘油管中-80 ℃保藏備用。

2.2 突變體的表達與純化

將突變體接種到TM 培養基中，37 ℃培養10-12 h 后按5%的接種量再次轉接到TM 培養基中，30 ℃繼續搖瓶發酵48 h。結束后離心取上清，即可獲得粗酶液。SDS-PAGE 電泳結果如圖1 所示，由實驗結果可知，三個突變體發酵上清在57.6 kD 處都有可觀的目的蛋白條帶，其大小與理論的β-淀粉酶分子量相符合，表明β-淀粉酶在B.choshinensis中成功表達。將粗酶液通過凝膠柱Superdex 200 10/300 GL 進行蛋白純化，獲得電泳純蛋白（圖1），用于下一步實驗。

圖1 SDS-PAGE 電泳圖Fig.1 SDS-PAGE analysis of mutants

2.3 突變體酶學性質分析

在60 ℃，pH5.5 的條件下測得野生型與突變體的 T47K，Y164K，L396K比活力分別為208.2，93.3，425.7 U/mg，是野生型的33.3%，14.9%，68.1 %。

將酶液分別用pH 3～8 的Na2HPO4-C4H2O7緩沖液（0.05 mmol/L）稀釋至一定倍數。以2%可溶性淀粉作為底物，底物與緩沖液混合后在50 ℃水浴鍋中預熱10 min，然后分別在標準條件下測定這些突變體在不同pH 條件下的酶活。以酶活最高者為100%計算，算出相對酶活，結果見圖2。實驗結果顯示，T47K，Y164K，L396K 三個突變體均取得預期改變，最適pH 值均有降低，由野生型的7.0 分別降為6.0、4.5、5.5。此外也印證了Y164 位點對pH 影響的文獻報道[16]。

圖2 p H 對野生型及突變體酶活的影響Fig.2 Effect of pH on enzyme acitivity of the wild-type and mutants

在突變體最適的pH 條件下，分別將稀釋一定倍數的突變體酶液與2%的淀粉溶液相混合，然后分別在35，40，45，50，55，60 ℃以及65 ℃的水浴鍋中保溫10 min。在標準條件下分別測定突變體在不同反應溫度下的酶活。以酶活力最高者為100%計算出其他的相對活力，結果如圖3 所示。實驗結果顯示，T47K，Y164K，L396K 三個突變體的最適反應溫度有較大的變化，分別為55，45，60 ℃。

圖3 溫度對野生型及突變體酶活的影響Fig.3 Effect of temperature on enzyme acitivity of the wild-type and mutants

實驗結果顯示，T47K，Y164K，L396K 三個突變體的最適pH 值均有降低，與此同時，最適反應溫度也有所變化，相對于野生型最適溫度50 ℃來說，Y164K 最適溫度降低到45 ℃，不利于應用于麥芽糖的生產。而L396K 突變體最適pH 降低到5.5，滿足了高純度麥芽糖漿生產中常用以復配的普魯蘭酶、麥芽糖淀粉酶等淀粉酶作用條件。同時，該突變體最適溫度升高為60 ℃，在麥芽糖生產的過程中，反應溫度的提高能夠更好的避免反應過程中產生雜菌，同時，普魯蘭酶、麥芽糖淀粉酶等同樣適用于這一溫度[10，17]，因此這一性質的改變更適于麥芽糖的工業生產，我們將對這一突變體的應用進行進一步探究。

2.4 β-淀粉酶加量對麥芽糖產率的影響

為了初步探究在實際生產中突變體L396K 和野生型的應用效果，配制10%（w/v）的馬鈴薯淀粉溶液，以12 U/g 淀粉的量加入α-淀粉酶液化至澄清。液化結束后分別加入4 U/g 淀粉的普魯蘭酶以及不同濃度的β-淀粉酶，這一過程中注意保溫防止液化液冷卻老化，然后在pH5.5，60 ℃的條件下進行糖化反應。

實驗結果如圖4 所示，當加酶量在10～100 U/g淀粉之間時，L396K β-淀粉酶糖化的一組麥芽糖產率要明顯高于突變前野生型β-淀粉酶，當突變體加酶量為100 U/g 淀粉時，麥芽糖轉化率基本恒定，為80.2%，此最高值相對于突變前的最高值77.5%高2%～3%。同時，這一麥芽糖含量滿足高純度麥芽糖漿的標準[18]。

圖4 野生型和突變體加酶量對麥芽糖轉化率的影響Fig.4 Relationship between β-amylase enzyme dosage and maltose yield

3 結語

以重組短小芽孢桿菌 B.choshinensis/pNCMO2/β-amy 菌株為基礎，對B.flexus 來源的β-淀粉酶進行定點突變，并對突變體進行酶學定性。選擇其中性質優良的突變體L396K 對其制備麥芽糖的轉化條件進行了優化。結果表明，在pH 5.5，60 ℃的條件下，β-淀粉酶加酶量為100 U/g 淀粉時達到麥芽糖產率的最大值，為80.2%，此麥芽糖含量滿足高純度麥芽糖漿的標準。這一結果表明該細菌來源的β-淀粉酶滿足工業生產應用的要求，而且相對于植物來源的β-淀粉酶，該細菌來源的β-淀粉酶具有生產工藝簡單，生產成本低，純度高等優點，具有很大的應用前景。