產(chǎn)果聚糖蔗糖酶重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建及表達(dá)

孫惟沁，沐萬孟，張 濤，江 波

（食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122）

低聚乳果糖（lactosucrose，LS）是由半乳糖、葡萄糖和果糖構(gòu)成的一種三糖。低聚乳果糖的吸濕性高、持水力強(qiáng)、在酸性條件下穩(wěn)定、甜度為蔗糖的30%[1]，與其他低聚糖甜味劑相比，低聚乳果糖的甜味質(zhì)量與蔗糖最為相近[2]。低聚乳果糖不能被人和小鼠腸道酶系水解[3]，但能夠被雙歧桿菌選擇性利用[2，4-5]，從而改善腸道微環(huán)境，攝入低聚乳果糖還能夠促進(jìn)鈣吸收[6]，抑制體脂積聚，預(yù)防肥胖[7]，調(diào)節(jié)免疫[8-9]。因此，低聚乳果糖被認(rèn)為是一種具有益生元效果的功能性低聚糖。在日本，低聚乳果糖被批準(zhǔn)作為特定保健食品（FOSHU）的功能性配料。

以蔗糖和乳糖為底物，酶法生產(chǎn)低聚乳果糖有兩種方法，一是通過環(huán)狀芽孢桿菌[10]來源的β-半乳糖苷酶將乳糖分解產(chǎn)生的β-半乳糖苷轉(zhuǎn)移到蔗糖中葡萄糖C4 位羥基上；二是通過多種來源（Aerobacter levanicum[11]、Bacillus natto[12]、Bacillus subtilis KCCM 32835[13]、Paenibacillus polymyxa IFO 3020[14]、Sterigmatomyces elviae ATCC 18894[15]等）的果聚糖蔗糖酶或節(jié)桿菌Arthrobacter sp.K-1[16]來源的β-呋喃果糖苷酶將蔗糖分解產(chǎn)生的果糖基轉(zhuǎn)移到乳糖還原性末端C1 位羥基上。目前，針對這些具有合成低聚乳果糖能力的酶的研究主要在高效野生菌株的篩選、化學(xué)試劑修飾[17]、固定化[15，18]、基因工程菌株的構(gòu)建[19-22]幾方面。

枯草芽孢桿菌有著長期制備發(fā)酵食品的歷史，被美國FDA 和中國農(nóng)業(yè)部等部門批準(zhǔn)為食品級安全菌株[23]，它具有培養(yǎng)簡單快速、蛋白分泌能力強(qiáng)、產(chǎn)物不易形成包涵體、非致病性、遺傳背景清楚、密碼子偏好性不明顯[24]的特點，是目前生產(chǎn)各種工業(yè)用酶，如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶的理想表達(dá)宿主[25]。目前對基因工程菌的研究報道均是以大腸桿菌作為表達(dá)系統(tǒng)，尚未有枯草芽孢桿菌表達(dá)。本研究擬將腸膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides B-512 FMC[25]編碼的果聚糖蔗糖酶基因分別克隆到單啟動子、雙啟動子表達(dá)載體上，并將質(zhì)粒導(dǎo)入枯草芽孢桿菌WB600 和1A751 中，構(gòu)建無抗菌株。對重組菌的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以實現(xiàn)果聚糖蔗糖酶的高效表達(dá)，為該酶的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒 實驗所用菌株和質(zhì)粒詳見表1。

表1 菌株與質(zhì)粒Table 1 Strain and plasmid

1.1.2 試劑和培養(yǎng)基 DNA 聚合酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase 和DL10 000 DNA Marker 購自大連寶生物工程有限公司；SanPrep 柱式質(zhì)粒DNA 小量抽提試劑盒和SanPrep 柱式DNA 膠回收試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖等其他常用試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

LB 培養(yǎng)基（g/L）：NaCl 10，胰蛋白胨10，酵母提取物5。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：酵母提取物20，胰蛋白胨25，K2HPO43，葡萄糖30。

1.2 實驗方法

1.2.1 果聚糖蔗糖酶目的基因的克隆與重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1）雙啟動子重組質(zhì)粒構(gòu)建。以pET-22b-LEME質(zhì)粒為模版，用引物P1 和P2 擴(kuò)增果聚糖蔗糖酶基因LEME 片段，以pUB-P43-DPE-dal 質(zhì)粒為模版，用引物P3 和P4 擴(kuò)增雙啟動子載體骨架pUB-P43-HPAII-dal片段，膠回收純化PCR產(chǎn)物，用NanoDrop 測定DNA 濃度，按照摩爾比1∶1 互為模版PCR，得到多聚體片段Poly-PH，將其轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌WB600 感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建重組菌株WB-PH。參照SanPrep 柱式質(zhì)粒DNA 小量抽提試劑盒方法提取重組菌株質(zhì)粒pUB-P43-HPAII-LEMEdal。

2)單啟動子重組質(zhì)粒構(gòu)建。單啟動子（P43 和HPAII）以pUB-P43-HPAII-LEME-dal 質(zhì)粒為模版，分別用引物P5、P6 和P7、P8 擴(kuò)增果聚糖蔗糖酶基因LEME＋P43 片段和LEME 片段，分別用引物P9、P10 和P11、P12 擴(kuò)增單啟動子載體骨架pUBdal 片段和pUB-HPAII-dal 片段，同上述雙啟動子方法一樣構(gòu)建多聚體片段Poly-P、Poly-H。

PCR 反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃解鏈10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，共30 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

預(yù)期得到3 種不同啟動子組合的質(zhì)粒見圖1。引物列表見表2。

圖1 不同啟動子組合質(zhì)粒Fig.1 Plasmids with different promoters

表2 引物列表Table 2 List of primers

1.2.2 重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建 枯草芽孢桿菌感受態(tài)按照文獻(xiàn)[28]制備。將Poly-PH、Poly-P、Poly-H 分別轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌WB600（dal-）和1A751（dal-）感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃、100 r/min 培養(yǎng)1 h，離心并用無菌水洗滌3 次，再用400 μL 無菌水重懸。取200 μL 菌液涂布在無抗LB 固體平板上，37 ℃12 h 培養(yǎng)，次日檢查并篩選成功轉(zhuǎn)化的陽性轉(zhuǎn)化子，表達(dá)在枯草芽孢桿菌WB600（dal-）中的命名分別為WB-PH、WB-P、WB-H，表達(dá)在枯草芽孢桿菌1A751（dal-）中的命名分別為1A-PH、1A-P、1A-H。

1.2.3 培養(yǎng)與表達(dá) 將構(gòu)建成功的重組菌在LB 平板上劃線活化，挑取單菌落接種于4 mL LB 培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)12 h 作為種子液。按照2%接種量接種于25 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃200 r/min培養(yǎng)15 h，收集發(fā)酵液。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析（SDS-PAGE）取1 mL 發(fā)酵液離心取菌體，加入1 mL 水重懸并煮沸10 min，冷卻后加入50 μL 濃度為20 mg/mL 的溶菌酶溶液，置于37 ℃水浴中1 h 進(jìn)行裂解。離心后取40 μL 上清液，向其中加入10 μL 5×SDS-PAGE Loading Buffer，沸水浴5 min。使用5%的濃縮膠，12%的分離膠進(jìn)行蛋白電泳，考馬斯亮藍(lán)R250 染色。

1.2.5 果聚糖蔗糖酶發(fā)酵酶活檢測 果聚糖蔗糖酶發(fā)酵酶活檢測：1 mL 反應(yīng)體系包括：15%蔗糖、15%乳糖、PBS 50 mmol/L pH 6.5、80 μL 發(fā)酵液。反應(yīng)條件：4 0℃，10 min。反應(yīng)完成后沸水浴10 min滅酶。

將滅酶的反應(yīng)液離心后取上清200 μL 加入800 μL 超純水中稀釋，用0.22 μm 濾膜過濾后上液相色譜檢測。

測定條件：高效液相色譜Agilent 1260 Infinity，色譜柱Waters Spherisorb Amino（NH2）Column，示差折光檢測器，流動相 乙腈∶甲醇∶水＝77∶13∶10（V∶V∶V），流速1 mL/min，柱溫35 ℃。

一個酶活單位（U）定義為pH 6.5，40 ℃條件下，每分鐘生成1 μmol 低聚乳果糖產(chǎn)物所需要的酶量。

1.2.6 菌體量測定 濕菌體重：取2 mL 發(fā)酵液于預(yù)先稱重的2 mL 離心管中，8 000 r/min 離心5 min，棄去上清后再次稱重，得到濕菌體質(zhì)量濃度，計算每毫升濕菌體重。

1.2.7 發(fā)酵條件優(yōu)化 氮源優(yōu)化：保持總氮含量不變，分別使用大豆蛋白胨、胰蛋白胨、魚粉蛋白胨、酵母提取物、尿素、NH4Cl、（NH4）2SO4、檸檬酸氫二銨、NH4H2PO4、CH3COONH4作為唯一氮源進(jìn)行發(fā)酵，測定菌體量和發(fā)酵酶活。確定最佳氮源后，改變氮源添加量，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測定菌體量和發(fā)酵酶活。

碳源優(yōu)化：保持總碳含量不變，分別使用葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、糊精、可溶性淀粉、甘油作為唯一碳源進(jìn)行發(fā)酵，測定菌體量和發(fā)酵酶活。確定最佳碳源后，改變碳源添加量，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測定菌體量和發(fā)酵酶活。

接種量：采用最佳碳源、氮源配制發(fā)酵培養(yǎng)基，按0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%接種量接種，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測定菌體量和發(fā)酵酶活。

裝液量：在250 mL 三角瓶和500 mL 三角瓶中分別裝25、50、75、100 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測定菌體量發(fā)酵酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的克隆與重組質(zhì)粒的構(gòu)建

通過PCR 方法，成功擴(kuò)增得到6 條基因片段，分別為pUB-P43-HPAII-LEME-dal 質(zhì)粒的目的基因片段（1 275 bp）、載體骨架片段（3 852 bp）、pUBP43-LEME-dal 質(zhì)粒的目的基因片段（1 575 bp）、載體骨架片段（3 225 bp）、pUB-HPAII-LEME-dal質(zhì)粒的目的基因片段（1 275 bp）、載體骨架片段（3 552 bp）。再以擴(kuò)增片段互為引物進(jìn)行PCR，成功得到了3 條多聚體片段Poly-PH、Poly-P、Poly-H，見圖2。

圖2 基因片段PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 PCR products of different genes

2.2 重組質(zhì)粒在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)

使用化學(xué)轉(zhuǎn)化方法，將Poly-PH、Poly-P、Poly-H 導(dǎo)入枯草芽孢桿菌1A751 和WB600 中。將陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測定其發(fā)酵酶活，結(jié)果如圖3所示，6 種重組菌均有酶活，其中雙啟動子質(zhì)粒對于果聚糖蔗糖酶表達(dá)的效果均優(yōu)于單啟動子質(zhì)粒，其中WB-PH 的發(fā)酵酶活最高（4.179 U/mL），是WB-P的17.3 倍，WB-H 的55.7 倍；1A-PH 的發(fā)酵酶活是1A-P 的7 倍，1A-H 的8.8 倍。文獻(xiàn)[29]將啟動子HPAII 多次串聯(lián)，經(jīng)串聯(lián)后的啟動子介導(dǎo)的納豆激酶活性較單個啟動子最多提高了92.51%。文獻(xiàn)[30]將兩個病原誘導(dǎo)物啟動子串聯(lián)并與編碼β-葡萄糖苷酸酶的基因uidA 融合，雙啟動子的誘導(dǎo)表達(dá)活性比單啟動子高了9 倍。結(jié)果表明，啟動子串聯(lián)能夠提高蛋白的表達(dá)量。

兩種枯草芽孢桿菌表達(dá)載體相比，WB-PH 的發(fā)酵酶活是1A-PH 的9.4 倍，其原因是與1A751 相比，WB600 敲除了6 個自身蛋白酶基因，因而外源蛋白能夠更穩(wěn)定的表達(dá)。綜上，后續(xù)實驗采用WB-PH作為研究對象。

圖3 重組菌的發(fā)酵酶活Fig.3 Enzyme activity of different recombinant strains

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果分析

2.3.1 氮源種類及用量 不同氮源對發(fā)酵酶活和菌體質(zhì)量濃度的影響見圖4。如圖4 所示，以大豆蛋白胨作為氮源能夠獲得最高發(fā)酵酶活（66.82 U/mL），其次是以酵母提取物作為氮源（13.38 U/mL）。有機(jī)氮源能明顯提高菌體量，其中以酵母提取物作為氮源，菌體量最大，其次是大豆蛋白胨、胰蛋白胨、魚粉蛋白胨。從結(jié)果中還可以發(fā)現(xiàn)，WB-PH 對無機(jī)氮源利用率很低，菌體量及發(fā)酵酶活均沒有提高。

圖4 不同氮源對發(fā)酵酶活和菌體量的影響Fig.4 Effects of nitrogen source on levansucrase production and biomass

以大豆蛋白胨作為氮源，考察不同添加量對發(fā)酵酶活的影響，結(jié)果如圖5 所示，大豆蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%時，發(fā)酵酶活最高。大豆蛋白胨含量在1%～8%范圍內(nèi)時，菌體質(zhì)量濃度與氮源質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)趨勢，發(fā)酵酶活先升高后降低，可能是由于大豆蛋白胨添加量較高的幾組中的菌體還處于生長階段，尚未進(jìn)入表達(dá)蛋白的時期。而大豆蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時菌體量減少，主要是由于濃度增加導(dǎo)致培養(yǎng)基粘度變大，在搖床培養(yǎng)時溶氧減少，枯草芽孢桿菌為好氧菌，生長受到了抑制。

圖5 大豆蛋白胨濃度對發(fā)酵酶活和菌體量的影響Fig.5 Effects of soy peptone concentration on levansucrase production and biomass

2.3.2 碳源種類及用量 保持總碳含量不變，分別使用葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、糊精、可溶性淀粉、甘油作為唯一碳源進(jìn)行發(fā)酵，考察不同種類碳源的影響，結(jié)果如圖6 所示，以果糖作為唯一碳源時，發(fā)酵酶活最高（64.58 U/mL），其次是葡萄糖（61.79 U/mL）和蔗糖（54.01 U/mL），3 者的菌體質(zhì)量濃度基本相同。考慮到三種碳源中，果糖成本較高，葡萄糖成本最低，故采用葡萄糖作為最佳碳源。

圖6 不同碳源對發(fā)酵酶活和菌體量的影響Fig.6 Effects of carbon source on levansucrase production and biomass

以葡萄糖作為碳源，考察不同添加量對發(fā)酵的影響，結(jié)果如圖7 所示，不同的葡萄糖添加量對菌體量的影響變化不大，考察范圍內(nèi)所有組別濕菌體重都在20～30 mg/mL 范圍之間，葡萄糖添加量為2%時，發(fā)酵酶活和菌體量均達(dá)最大值。

圖7 葡萄糖添加量對發(fā)酵酶活和菌體量的影響Fig.7 Effects of glucose concentration on levansucrase production and biomass

2.3.3 接種量 接種量會影響菌體的生長和蛋白的表達(dá)。接種量過低，菌體生長的延滯期時間會增長，從而延長了發(fā)酵周期；接種量過高，會使得菌體生長利用的營養(yǎng)物質(zhì)過多，對后期產(chǎn)酶不利。以最佳碳源、氮源配制發(fā)酵培養(yǎng)基，分別將種子液按0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%的接種量，接種至發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，考察不同接種量的影響，結(jié)果如圖8 所示，接種量為1%時，發(fā)酵酶活達(dá)最大值。

圖8 接種量對發(fā)酵酶活和菌體量的影響Fig.8 Effects of inoculum size on levansucrase production and biomass

2.3.4 裝液量 搖瓶裝液量的變化反映了溶氧水平的高低，枯草芽孢桿菌是好氧菌，因此發(fā)酵過程中充足的氧氣供給十分重要。在固定搖床轉(zhuǎn)速200 r/min 下，考察了250 mL 三角瓶和500 mL 三角瓶不同裝液量情況下對枯草芽孢桿菌生長的影響，結(jié)果如圖9、圖10 所示，發(fā)酵酶活和菌體量均隨著裝液量的增加而降低。相同裝液量條件下，使用的三角瓶體積越大，發(fā)酵酶活越高。可以發(fā)現(xiàn)充足的供氧對菌體生長和產(chǎn)酶都有提高作用。

圖9 裝液量對發(fā)酵酶活的影響Fig.9 Effects of culture volume on levansucrase production

圖10 裝液量對菌體量的影響Fig.10 Effects of culture volume on biomass

2.3.5 發(fā)酵時間 采用以上所有優(yōu)化過的條件，進(jìn)行搖瓶連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)，每隔一段時間取樣測定濕菌體重、發(fā)酵酶活，結(jié)果如圖11 所示。從圖中可以看出，在3 h 后菌體生長進(jìn)入對數(shù)期，15 h 后達(dá)到平臺期，21 h 濕菌質(zhì)量濃度達(dá)到最大值29.6 mg/mL，之后逐漸降低。發(fā)酵酶活在發(fā)酵4 h 以后開始逐漸升高，在9～18h 期間升高速率最快，18 h 發(fā)酵酶活達(dá)最大值108.34 U/mL。18 h 以后酶活開始降低，分析原因主要是由于菌體開始凋亡，胞內(nèi)的蛋白酶被釋放出來，降解自身原有蛋白的同時也將果聚糖蔗糖酶蛋白分解了。

圖11 發(fā)酵時間對發(fā)酵酶活和菌體量的影響Fig.11 Effects of fermentation time on levansucrase production and biomass

3 結(jié)語

將來源于腸膜明串珠菌 Leuconostoc mesenteroides B-512 FMC 的果聚糖蔗糖酶基因克隆并構(gòu)建了3 種不同啟動子組合的質(zhì)粒，分別導(dǎo)入枯草芽孢桿菌WB600 和1A751 后，經(jīng)過發(fā)酵比較酶活，確定了WB-PH 的發(fā)酵酶活最高。將WB-PH的發(fā)酵條件進(jìn)行單因素實驗優(yōu)化，確定了發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：20 g/L 葡萄糖，20 g/L 大豆蛋白胨；培養(yǎng)條件為：接種量1%，裝液量5%（V∶V），發(fā)酵周期18 h，培養(yǎng)溫度37℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min。在該培養(yǎng)條件下產(chǎn)果聚糖蔗糖酶的發(fā)酵酶活最高可達(dá)108.34 U/mL，約為優(yōu)化前的25.92 倍，為下一步利用果聚糖蔗糖酶以蔗糖和乳糖為底物高效合成低聚乳果糖提供了基礎(chǔ)。