RNAi 靶向沉默opaque2 基因對高粱醇溶蛋白含量的影響

蔡欣月，李志江，牛江帥，包 丹，蘇 晨，孫藝墨，戴凌燕*

（1.黑龍江八一農墾大學 生命科學技術學院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農墾大學 食品學院，黑龍江大慶 163319）

高粱（Sorghum bicolor（L.）Moench）是世界主要糧食作物之一，也可作為動物飼料，在世界發達及發展中國家種植面積較大，廣泛分布在亞、非和美洲等熱帶干旱、半干旱地區。在中國，高粱年均種植面積約為722 400 hm2，產量可達2 865 000 萬t，為世界第四大高粱主產國[1]。高粱可在干旱邊際土地上種植，不與玉米、小麥和水稻爭奪農業用地。因此，隨著世界總人口不斷增加，極端氣候頻繁出現，可利用水資源日漸減少，土地鹽漬化逐年加劇，高粱作為抗旱耐逆的經濟作物，必將在農牧業生產中占有重要戰略地位。

高粱籽粒包含淀粉、蛋白質、脂肪、纖維素和少量的灰分及蠟質。蛋白質約含6.8%～19.6%，是高粱中除淀粉以外含量最多的成分[2]。但是，高粱蛋白富含半胱氨酸，缺乏人體必需的賴氨酸和色氨酸，在禾谷類作物中消化率最低，約為30%～80%[3]，且會導致以高粱為主要蛋白食物的人嚴重營養不良[4]。高粱的主要貯藏蛋白為醇溶蛋白，約占高粱總蛋白的77%～82%[5]，根據蛋白質分子量和氨基酸序列組成被分成α、β、γ 和δ 醇溶蛋白，與玉米相似[6-7]。而α-醇溶蛋白占高粱醇溶蛋白總量的66%～84%[8]。而轉錄因子Opaque2（O2）可通過識別啟動子上O2 box（TCCACGT）來調控玉米22 kDa α-醇溶蛋白和15 kDa β-醇溶蛋白的基因表達[9-10]，O2 基因的突變能降低α-醇溶蛋白的含量，在有的玉米近交品系中α-醇溶蛋白能減少60%以上[11]，并會增加富含賴氨酸和酪氨酸蛋白質的積累[12]。隨著社會和經濟的發展，人們追求高生活品質的同時很注重保健。在食物方面更青睞營養價值高，有益于健康的粗糧食材，而高粱產品從古至今一直被人們所喜愛。因此，有望在高粱醇溶蛋白合成調控基礎上，通過生物技術遺傳轉化改良高粱蛋白質的營養品質。

目前為止，高粱育種主要集中在增加產量、提高抗性和降低單寧等方面，而在降低醇溶蛋白含量方面罕見報道。眾所周知，傳統育種針對性較差、分子機制不清楚、且費時耗力，收效??；而通過生物技術進行遺傳轉化可省時，收效大。近年產生的新技術RNA 干擾（RNA interference，RNAi）介導的基因沉默具有特異、高效的特點，植物中運用轉基因技術所形成的RNAi 可以遺傳到下一代。本研究將構建的opaque2 基因RNA 抑制表達載體利用農桿菌介導轉化高粱幼胚，通過測定轉基因植株籽粒中醇溶蛋白含量，觀察胚乳中蛋白質體形狀變化，以及SDS-PAGE 電泳檢測等來分析RNAi 靶向沉默opaque2 基因對高粱醇溶蛋白含量的影響。以期篩選出籽粒中醇溶蛋白含量低的優質株系，為擴展高粱的遺傳基礎和加快高粱品質育種進程提供種質資源和方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

高粱品種P898012 由美國密蘇里大學哥倫比亞分校遺傳轉化中心張展元實驗室惠贈；高粱組織培養中激素類IAA、6-BA 和IBA 均購自美國Sigma公司；頭孢噻肟購自美國Caisson 公司；草銨膦購自美國Sigma 公司；限制性內切酶BamHI、SpeI、KpnI、SacI、HindIII 和EcoRI，T4 DNA連接酶，Taq 聚合酶，載體T-Vector pMD20 等購自寶生物工程有限公司（大連）；PCR 產物純化和質粒提取等試劑盒均購自天根生化科技有限公司（北京）；TRIZOL 購自美國invitrogen 公司；所有引物均由上海生工公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNAi 抑制表達載體構建 以GenBank 核酸數據庫中高粱opaque2 基因序列（登錄號X71636）上第1 個外顯子設計引物。一對引物帶有BamHI和SpeI 酶切位點；另一對帶有KpnI 和SacI 酶切位點。將2 個擴增目的片段分別連接到植物載體p130035SI-X 上，然后再用HindIII 和EcoRI 將帶有35S、目標片段和NOS 片段切下后連接到pCambia3300 載體上，用篩選抗性草銨磷（Bar）基因替換掉潮霉素（hptII）基因。

1.2.2 高粱幼胚遺傳轉化 高粱幼胚的遺傳轉化體系參照Do 等的方法進行[13]。取授粉11～14 d 高粱籽粒，經消毒后剝離幼胚作為外植體。將opaque2 基因的RNAi 抑制表達載體轉入農桿菌AGL1 中，利用農桿菌介導轉化高粱幼胚，通過誘導愈傷、草銨磷抗性篩選芽分化、根分化過程來獲得再生轉基因植株。

1.2.3 再生植株的陽性檢測與分析

1）再生植株的PCR 檢測。再生植株先通過葉片涂抹草銨磷溶液來進行初步篩選，若葉片涂抹處未變黃焦枯，則初步認定其為陽性轉基因植株。然后提取葉片DNA，使用Bar 基因和載體上序列設計引物進行PCR 檢測確定。構建載體及再生植株陽性檢測的引物見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2）轉基因植株實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測。取葉片檢測呈陽性植株開花20 d 的籽粒，用Trizol 試劑盒分別提取胚乳總RNA，依據產品說明書，使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 反轉錄試劑盒進行反轉錄。以高粱actin 基因為內參（擴增引物為actin-F：TTGGGTCAGAAA GGTTCAGG 和actin-R：TGCTCATTCGATCAGCAAT C），以opaque2 基因序列設計引物（o2-F：CAAGCTG AAGAGCCAACCAT 和o2-R：AGAGTTGATCCGGA GGAGGT），利用SYBR 熒光染料法進行qRT-PCR檢測，并分析opaque2 基因的相對表達量。

1.2.4 高粱籽粒醇溶蛋白含量測定及SDS-PAGE電泳 高粱籽粒中醇溶蛋白含量測定參照文獻[14]。各轉基因植株收獲籽粒后，隨機取20 粒烘干至恒重后，研磨至粉末狀。稱取高粱籽粒粉末50 mg加到2.0 mL 離心管中，按1∶10 比例（g/mL）加入含4% DDT 的60%叔丁醇提取液500 μL，混勻后在37℃水浴過夜提取，8 000 r/min 離心15 min，取上清測定醇溶蛋白含量。蛋白含量測定采用考馬斯亮蘭G-250 方法。高粱籽粒醇溶蛋白SDS-PAGE 電泳參照Hamaker 的方法進行[15]，略有修改。取300 μL 提取液減壓蒸發溶劑，使蛋白質沉淀。加入100 μL 5X電泳上樣緩沖液（不含溴酚藍）溶解蛋白質。取10 μL 溶解蛋白樣品與10 μL 的含有溴酚藍的5X 電泳上樣緩沖液混合后沸水浴處理5 min，取15 μL樣品用15%的分離膠電泳檢測。

1.2.5 高粱籽粒透射電鏡觀察 高粱籽粒用2.5%戊二醛在4 ℃固定，PBS 緩沖液沖洗3 次。1%鋨酸在4 ℃后固定2 h，仍用PBS 緩沖液沖洗3 次。使用30%、50%、70%、90%和100%系列的乙醇梯度脫水，每次10 min，100%乙醇梯度脫水2 次。然后用Epon812 環氧樹脂包埋，在37、45 ℃和65 ℃溫箱固化，各級溫度固化24 h。經UltracutE 超薄切片機切片，醋酸雙氧鈾硝酸鉛染色后，用日立H-7560 透射電子顯微鏡觀察并拍照。

2 結果與分析

2.1 構建RNAi 抑制表達載體

RNAi 抑制表達載體構建過程如圖1 所示。用高粱opaque2 基因序列第1 個外顯子上帶有BamHI和SpeI 酶切位點，KpnI 和SacI 酶切位點的兩對引物進行RT-PCR，分別擴增出2 條長度約為224 bp的目標片段（圖1（a））。在將2 條目標片段1 正1 反分別連接到植物載體p130035SI-X 上后，用BamHI和SacI 2 個內切酶酶切載體進行驗證。由于載體上連接的2 條目標序列間還存在1 個118 bp 長度的內含子，在酶切后產生除線性載體外的一個約566 bp 的短片段（圖1（b））。由于載體p130035SI-X 上的植物抗性篩選基因為hptII 基因，其不利于高粱抗性植株的篩選。因此，使用HindIII 和EcoRI 將新構建的p130035SI-X 載體上帶有35S 啟動子、目標片段和 NOS 終止子片段切下后連接到pCambia3300 載體上，用篩選抗性Bar 基因替換掉hptII 基因。用HindIII 和EcoRI 2 個內切酶酶切新構建的pCambia3300 載體進行驗證，產生除線性載體外的一個約1 700 bp 的片段（圖1（c）），結果表明帶有opaque2 基因片段的RNAi 抑制表達載體構建成功。

圖1 RNAi 載體構建電泳Fig.1 Electrophoregram of RNAi vector construction

2.2 農桿菌介導opaque2 基因RNAi 抑制表達載體轉化高粱

以高粱幼胚為外植體，利用農桿菌將opaque2基因RNAi 抑制表達載體轉化高粱品種P898012 的過程如圖2 所示。農桿菌轉化幼胚共培養3 d 后，幼胚長大并在胚周圍產生色素（圖2（a））。在草銨磷抗性篩選培養基上，抗性愈傷白色致密，而非抗性愈傷則水浸狀褐色，甚至變黑（圖2（b））。在誘導芽分化的草銨磷抗性篩選培養基上，抗性愈傷組織可先后分化出從生苗，而有些愈傷則變黑壞死（圖2（c））。將苗轉移到生根培養基上誘導生根（圖2（d））后，移苗至土中。

圖2 高粱遺傳轉化Fig.2 Genetic transformation of sorghum

2.3 陽性轉基因植株檢測與分析

2.3.1 轉基因植株的PCR 檢測 再生幼苗葉片涂抹100 mg/L 草銨磷，若涂抹葉片在3 片以上未發生黃褐色焦枯，則初步認為其為陽性植株。取葉片提取DNA，用Bar 基因引物以葉片DNA 為模板進行PCR 擴增，目標片段約為552 bp，結果見圖3（a），野生型植株未擴增出目標條帶，而有些轉基因植株可擴增出目標條帶。再用載體上兩個插入片段間內含子設計的上游引物，和在其后載體上設計的下游引物，以DNA 為模板進行PCR 擴增，目標片段約為591 bp，結果見圖3（b）?？梢?，在pCambia3300 載體上擴增出極亮目標條帶，而在以H2O 為模板的陰性對照和野生型植株中均未擴出目標條帶；有些轉基因植株可擴增出目標條帶。經過多次檢測，將用不同引物可同時擴增出相應目標條帶的植株確定為轉基因植株，本試驗共獲得5 株。

2.3.2 轉基因植株的qRT-PCR 檢測分析 以高粱actin 基因為內參，采用qRT-PCR 對高粱胚乳中opaque2 基因的表達量進行檢測，見圖4。結果表明，除1 號外，其余4 株轉基因植株中opaque2 基因的表達量較對照顯著降低（P＜0.05），但不同植株表現不同，12 號下降程度更大?？梢姡ㄟ^RNAi 技術可對轉基因高粱植株opaque2 基因造成不同程度的干擾。

圖3 陽性植株檢測電泳圖Fig.3 Electrophoregram of detecting the positive plants

2.4 高粱籽粒醇溶蛋白含量測定及SDS-PAGE電泳

2.4.1 籽粒中醇溶蛋白含量測定 RNAi 抑制opaque2 轉基因高粱籽粒醇溶蛋白含量見圖5。從圖5 中可見，與野生型相比，轉基因植株中4 株籽粒的醇溶蛋白含量顯著降低（P＜0.05），只有1 號植株醇溶蛋白含量未下降?？梢?，通過RNAi 抑制opaque2基因可有效影響高粱籽粒中醇溶蛋白的合成和積累。文獻[15]在玉米上的研究表明，以opaque2（o2）基因突變體W64Ao2 為材料，運用RNAi 技術抑制Ohp（O2 heterodimerizing protein）、Pbf（Prolaminebox binding factor）的突變體和Pbf/Ohp 雙基因突變體，其醇溶蛋白含量與野生型相比分別下降83%、89%和90%，opaque2、PBF 及OHP 三者間以效應物和協同作用的模式在轉錄水平上調控醇溶蛋白基因表達。但本實驗中轉基因植株中醇溶蛋白含量未與RNAi 抑制opaque2 基因程度完全吻合，其原因還需進一步研究。

圖4 轉基因植株opaque2 基因表達的qRT-PCR 檢測結果Fig.4 Result of opaque2 gene expression in the transgenic plants by qRT-PCR assay

圖5 高粱籽粒中醇溶蛋白含量Fig.5 Kafirin content in grains

2.4.2 醇溶蛋白SDS-PAGE 電泳 醇溶蛋白SDSPAGE 電泳如圖6，供試野生型和各轉基因植株的醇溶蛋白SDS-PAGE 電泳帶型相同，約在15、20 kDa 和22 kDa 處出現3 條帶，可推測通過RNAi 技術抑制opaque2 基因后，僅影響了醇溶蛋白含量，而未影響醇溶蛋白種類及存在方式。參照文獻[15]對高賴氨酸高粱突變體P721 Q 進行SDS-PAGE 電泳結果可知，20 kDa 處條帶為β-醇溶蛋白，22 KDa處條帶為α-醇溶蛋白，但缺少分子量較大的γ-醇溶蛋白條帶。參照玉米醇溶蛋白SDS-PAGE 電泳結果[15-16]推測15 KDa 處的可能為高粱的δ-醇溶蛋白。

圖6 高粱籽粒中醇溶蛋白SDS-PAGE 電泳Fig.6 SDS-PAGE analysis of kafirin in grains

2.5 高粱籽粒胚乳細胞透射電鏡觀察結果

選取轉基因植株9 號和野生型高粱籽粒進行透射電鏡觀察，結果見圖7。野生型胚乳細胞中淀粉粒排列緊密，部分大淀粉粒融合成大塊狀；而轉基因植株淀粉粒排列疏松，細胞中存在多處孔隙（圖7中1、2，4，5）。野生型胚乳細胞中蛋白質體數量較多且有一些體積較大，而轉基因植株蛋白質體數量較少，體積較?。▓D7 中2、3、5、6）。有研究報道，玉米o2 基因突變體在灌漿過程中蛋白質體體積明顯變小[16]，這與本試驗結果一致。有研究表明，玉米籽粒胚乳中由于α-醇溶蛋白含量的降低，蛋白質體的數量變少且體積變小，在種核脫水過程中不能形成堅硬、致密的組織，容易導致玉米種核松軟、易碎[17]。本試驗中轉基因植株籽粒胚乳細胞內含物排列不緊密，空隙多，也可能由于高粱籽粒在灌漿脫水過程中蛋白質體數量減少和體積變小所導致，進而使籽粒中醇溶蛋白含量降低。

圖7 高粱籽粒胚乳細胞中淀粉粒和蛋白質體的透射電鏡觀察Fig.7 Transmission electron microscopy of starch granule and protein bodies in endosperm of sorghum grain

3 結語

本研究獲得了通過RNAi 技術抑制opaque2 基因的高粱轉基因植株，其中80%的植株籽粒中醇溶蛋白含量降低，但由opaque2 基因調控的降低機制還需深入研究。同時，所得種子后代品質特性也需進一步確定。