利用重組枯草芽孢桿菌產Bacillus pumilus 來源的γ-谷氨酰轉肽酶及其在L-茶氨酸合成中的應用

KOMERA Irene，楊套偉，張 顯，饒志明，徐美娟

（江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

茶具有強身健體、治療疾病等之藥物療效。現代醫(yī)學研究證實，這些功效與茶葉含有的功能氨基酸L-茶氨酸有密切的關系[1]。L-茶氨酸是由日本學者Sakato 首次從玉露綠茶中分離提取得到并因此而命名[2]。L-茶氨酸是存在于茶類植物中的一種天然氨基酸，對茶葉的品質和風味具有重要影響。L-茶氨酸作為茶葉三大天然提取物之一，其安全性已經得到眾多國家的共同認可。對人體具有多方面的健康功效，其作為一種“天然鎮(zhèn)靜劑”添加在多種食品、飲品及保健品，需求量日益增加[1]。

目前，L-茶氨酸的生產方法主要有茶葉提取法，化學合成法和酶轉化法3 種。L-茶氨酸一般占干茶葉比重達1%～3%[3]，因此，通過茶葉提取L-茶氨酸具有提取率低、周期長、成本高等缺點。化學法合成茶氨酸的缺點為反應條件劇烈，反應過程中難以避免有機試劑的使用，同時產物多為D-型和L-型茶氨酸異構體混合物[4]。酶催化法因其反應條件溫和、專一性高、催化效率高等優(yōu)點而備受關注，據報道，主要有四種酶類能夠催化合成L-茶氨酸：L-谷氨酰胺合成酶，L-谷氨酰胺酶，γ-谷氨酰甲胺合成酶和γ-谷氨酰轉肽酶，而γ-谷氨酰轉肽酶催化反應因不需要ATP 的參與而廣受青睞[5]。

本研究克隆了一種來源于Bacillus pumilus ML413 的γ-谷氨酰轉肽酶（GGT），并在安全菌株Bacillus subtilis 168 中進行了表達，并研究了該重組GGT 催化合成L-茶氨酸中的應用。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

1.1.1 菌株 本研究采用模式菌株Escherichia coli 109 作為克隆宿主，模式菌株Bacillus subtilis 168作為表達宿主。以本研究室前期篩選并保藏的B.pumilus ML413 全基因組為模板，利用引物對ggt-F/ggt-his tag-R 通過PCR 擴增獲得ggt 基因，隨后用限制性內切酶BamH I 和Mlu I 分別處理ggt 基因和表達載體pMA5-HpaII，最后將純化后基因和載體進行連接，獲得重組載體pMA5-ggt，采用化學方法將其轉化至B.subtilis 168 中[6]，獲得重組菌B.subtilis 168/pMA5-ggt，并將其命名為BsG。

1.1.2 引物 本研究所用引物見表1。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

菌株活化、種子培養(yǎng)主要采用LB 液體培養(yǎng)基（g/L）：氯化鈉10，Tryptone 10，Yeast Extract 5。旋轉式搖床培養(yǎng)，搖床轉速160 r/min，培養(yǎng)溫度37 ℃。

轉化子篩選采用LB 固體培養(yǎng)基，根據需要加入氨芐青霉素100 μg/mL 或卡那霉素50 μg/mL。

產酶發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖10，yeast extract 20，玉米漿15，MgSO4·7H2O 1，K2HPO4·3H2O 2，pH 7.2。搖床轉速160 r/min，培養(yǎng)溫度37 ℃。

1.3 實驗方法

1.3.1 重組菌GGT 粗酶液的制備 重組菌培養(yǎng)結束后，離心（10 000 r/min，30 min），上清液即為胞外GGT 粗酶液。離心獲得的細胞用Tris-HCl 緩沖液（pH 8.0）洗滌2～3 次，細胞懸浮液采用超聲波破碎，離心（10 000 r/min，30 min）獲得胞內GGT 粗酶液。上述GGT 粗酶液均置于4 ℃保存，用于后續(xù)實驗。

1.3.2 GGT 酶活力的測定 酶活反應體系參照文獻 [7]，1 mL反應體系中包含：50 mmol/L 硼酸-NaOH 緩沖液（pH 10.0），2.5 mmol/L γ-GpNA，60 mmol/L 雙甘二肽，20 μL 適當稀釋的酶液。37 ℃反應10 min 后，添加125 μL 濃度為3.5 mol/L 的醋酸終止反應。以不添加雙甘二肽受體的反應液作為對照，采用分光光度計在410 nm 處測定吸光度差值。酶活單位定義為：1 min 內經由轉肽反應催化生成1 μmol 對硝基苯胺（p-Nitrophenylamine）所需酶量即為一個酶活單位（U）。

1.3.3 重組酶純化 將上述所得的粗酶液先經0.45 μm 濾膜過濾后，利用Ni-NTA 蛋白純化柱進行純化，先用不含咪唑的緩沖液洗脫雜蛋白，再用不同濃度的咪唑緩沖液進行梯度洗脫，依據酶分子的大小與金屬離子的結合牢固程度，在一定的咪唑濃度條件下，可以得到較純的酶液。

1.3.4 酶法合成L-茶氨酸體系 轉化體系主要包含：L-谷氨酰胺，乙胺，GGT 蛋白酶，50 mmol/L 硼酸-NaOH 緩沖液（pH 10.0），37 ℃反應結束后，添加10%的TCA 終止反應。

1.3.5 L-茶氨酸分析方法 采用高效液相色譜（HPLC）來測定L-茶氨酸的含量[7]。轉化液離心后先用0.24 μm 濾膜過濾后處理。利用OPA 柱前進行衍生。HPLC 條件：Angilent 1260；色譜柱：Hypersil ODS C18（4.0 mm×125 mm）。流動相A（8 g/L 醋酸鈉，225 μL/L 三乙胺，5 ml/L 四氫呋喃，pH 7.2）和流動相B（30 g/L 醋酸鈉，pH 7.2/乙腈/甲醇（1∶2∶2，V/V））的梯度洗脫程序為：保留時間為0、27.5、31.5、34、35、40 min 時，A/B 分別為92∶8、40∶60、0∶100、0∶100、92∶8、92∶8；流速：1.0 mL/min；紫外檢測器；檢測波長：338 nm；柱溫：40 ℃。

2 結果與討論

2.1 B.pumilus 來源的γ-谷氨酰轉肽酶在B.subtilis 168 中的表達分析

將重組B.subtilis 接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃條件下培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結束后離心收集上清液，獲得GGT 粗酶液。隨后用AKATA purifier 對GGT 粗酶液進行純化，獲得GGT 純酶液。對GGT 粗酶液和純酶液進行SDS-PAGE 分析發(fā)現（圖1），B.pumilus來源的γ-谷氨酰轉肽酶成功在B.subtilis 168 中進行了表達，該GGT 蛋白是由大小分別為38、23 kDa的兩個大小亞基組成的二聚體蛋白。

圖1 重組B.subtilis 發(fā)酵上清和純化液SDS-PAGE 分析Fig.1 SDS-PAGE of crude and purified enzyme of recombinant B.subtilis

同時，按照1.3.2 節(jié)所述的GGT 活力測定方法，對的重組B.subtilis 胞內外GGT 活力進行了檢測，結果表明，發(fā)酵培養(yǎng)24 h，重組B.subtilis 胞外GGT活力達到3 U/mL，而胞內GGT 酶活只有0.2 U/mL，說明重組B.subtilis 產的GGT 為胞外分泌表達。

2.3 重組B.subtilis 發(fā)酵上清液中GGT 催化生產L-茶氨酸能力分析

考察了重組B.subtilis 胞外GGT 蛋白催化合成L-茶氨酸的能力，酶催化反應體系如下：20 mmol/L 的L-谷氨酰胺，40 mmol/L 的乙胺，GGT 酶液濃度為0.04 U/mL，反應體系pH 10，37 ℃條件下反應5 h 后，添加三氯乙酸（TCA）至終濃度為10%終止反應。反應液適當稀釋過濾后進行HPLCMASS 分析，結果如圖2 所示，說明該酶具備催化生成L-茶氨酸的能力。

圖2 重組GGT 催化合成L-茶氨酸能力分析Fig.2 Identification of L-theanine synthesized by the recombinant GGT

2.4 重組GGT 催化特征分析

GGT 催化γ-谷氨酰類化合物的γ-谷氨酰分子轉移到其他氨基酸、短肽等受體分子上（轉肽反應）或水分子上（水解反應），因此，要抑制水解等副反應的發(fā)生。據研究報道，GGT 催化反應特性與反應pH 密切相關，同時還主要受酶添加量、乙胺濃度等因素影響[8]。

首先，考察了GGT 在不同pH（4～12）條件下的催化特征，結果如圖3 所示，在pH 7～9 范圍內，GGT 水解活力和轉肽活力都比較大，說明在此環(huán)境中，產物除了茶氨酸外，還會有大量副產物L-谷氨酸的積累。而當控制pH=10 時，GGT 水解活力和轉肽活力都顯著下降，但是GGT 水解活力下降更為明顯，而轉肽活力仍保持較高水平，因此，選用pH 10作為L-茶氨酸合成的最適pH。

為了降低水分子與底物L-谷氨酰胺對受體乙胺的競爭力，反應過程中需要保證受體乙胺的用量大于供體L-谷氨酰胺用量，因此，考察了乙胺濃度（20～240 mmol/L）對茶氨酸合成的影響。結果如圖4所示，隨著乙胺添加量的增加，L-茶氨酸產量逐漸提高，當乙胺濃度為200 mmol/L，即谷氨酰胺∶乙胺=1∶10 時，茶氨酸產量最大。

酶的添加量對酶催化反應具有重要影響，因此，考察了GGT 添加量對L-谷氨酰胺轉化率的影響。結果如圖5 所示，隨著GGT 添加量的增加，底物L-谷氨酰胺轉化率逐漸提高，當GGT 添加量為1 U/mL 時，底物轉化率最高達到87.2%，繼續(xù)增加酶量，轉化率略有下降，因此，確定GGT 的最適添加量為1 U/mL。

圖3 p H 對GGT 轉肽和水解活力的影響Fig.3 Effects of pH to GGT activity

圖4 谷氨酰胺與乙胺添加比對茶氨酸合成的影響Fig.4 Substrate ratio optimization

圖5 GGT 添加量對茶氨酸合成的影響Fig.5 Effects of GGT dosage on theanine production

2.5 流加轉化

為了進一步提高茶氨酸產量，需要添加高濃度的底物，然而，高濃度的乙胺對GGT 具有抑制作用，L-谷氨酰胺溶解度較低，同時，L-谷氨酰胺和乙胺的添加比例和用量對茶氨酸合成具有較大的影響。批次流加底物是解決上述不利因素的有效策略。初始轉化體積為1 L，L-谷氨酰胺和乙胺初始添加量分別為20 mmol/L 和60 mmol/L，轉化體系中添加1.0 U/mL 的GGT，每隔3 h 補加同樣濃度的L-谷氨酰胺和乙胺，轉化條件一直維持在pH 10，37 ℃；直至茶氨酸產量幾乎不增加時停止反應，轉化16 h，茶氨酸產量達到50.8 g/L（圖6）。

圖6 批次流加合成L-茶氨酸Fig.6 Fed-batch production of L-theanine

2.6 利用發(fā)酵液催化合成L-茶氨酸

由于重組B.subtilis 生產的GGT 為胞外表達，且胞外GGT 酶活達到3 U/mL，因此，從未來生產應用的角度，考慮在重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵產酶結束后，直接在發(fā)酵液中加入底物進行L-茶氨酸的生物合成，設計了帶細胞的發(fā)酵液和除細胞的發(fā)酵液上兩個實驗清。結果如圖7 所示，兩種情況下最終的L-茶氨酸濃度基本一致，但是利用發(fā)酵液進行催化時，底物消耗和產物合成速度較利用上清作為催化劑時效率略高，同時副產物L-谷氨酸初始積累量也偏好，但副產物L-谷氨酸最終積累量基本沒有差別，可能原因是發(fā)酵液中除了上清液中的GGT 外，還包括細胞內的GGT，因此其GGT 總活力較高。另外，在發(fā)酵液中L-茶氨酸合成效率與在硼酸-NaOH緩沖液體系中的效率相差不大，因此，從未來生產應用的角度考慮，直接在重組B.subtilis 發(fā)酵液中加入底物進行L-茶氨酸的催化合成具有較好的前景。

3 結語

前期已報道的研究中，多采用大腸桿菌作為GGT 的表達宿主[9]，這在食品安全上存在一定的安全隱患。選用安全菌株B.subtilis 168 作為宿主菌，克隆表達B.pumilus 來源的γ-谷氨酰轉肽酶，并對該酶的催化特征以及催化合成L-茶氨酸的催化條件進行了優(yōu)化，通過補料分批流加催化16 h，L-茶氨酸產量達到50.8 g/L，該結果與文獻[8]以大腸桿菌作為宿主菌表達GGT 并催化合成L-茶氨酸的產量相媲美。另外，直接在重組B.subtilis 發(fā)酵液中加入底物進行L-茶氨酸的催化合成具有較好的前景。選用FDA 認可的B.subtilis 168 作為宿主菌更符合工業(yè)化安全生產的要求。

圖7 利用發(fā)酵液催化合成L-茶氨酸Fig.7 Biosynthesis of L-theanine with fermentation broth