一株鋅抗性菌株強化印度芥菜修復鋅污染土壤的可行性研究

杜憲正，王 濤，鄒路易，郁紅艷，張海利，滕 躍

（江南大學 環境與土木工程學院，江蘇 無錫 214122）

隨著工業農業生產規模的不斷擴大，土壤重金屬污染日益嚴重。鋅是動植物生長發育所必需的微量元素，但是土壤中鋅含量過多時，會在食物鏈中積累、遷移和傳遞，最終會對人體健康帶來極大威脅[1-2]。目前，傳統的污染土壤修復技術如客土法、土壤淋洗、電動修復、電熱修復、穩定化/固化等，不但治理費用高，還嚴重破壞土壤結構，易引起土壤肥力下降，治理過程中使用的化學試劑可能導致土壤二次污染。而通過植物（特別是超積累植物）結合相關微生物從污染環境中吸收、富集和轉移重金屬，從而降低環境中污染重金屬的濃度的生物修復技術，是一種投資少、成本低、不引起二次污染、可美化景觀的新興技術，逐漸成為國內外研究的熱點[3]。

迄今為止，國外已發現的鋅超積累植物達20余種，國內也發現東南景天、黑麥草、木賊、香附子及蓖麻、印度芥菜等鋅超富集植物[4-5]。但是這些已發現的重金屬超積累植物由于生長周期長、生物量小等因素，嚴重限制了它們用于工程修復重金屬污染土壤的潛力[6]。研究發現，根際微生物一方面可以為植物生長提供生長所需的營養元素以促進植物生長，如一些根際促生菌（PGPR）具有固氮、溶磷、解鉀的作用，可以保證植物在污染環境中生長發育所需營養物質的供給[7]；另一方面，根際微生物可以通過自身分泌物土壤環境中重金屬提高鋅在土壤中的活性和生物有效性，促進植物對鋅的吸收和富集[8]。同時，根際微生物還具有固氮、溶磷、供鐵及增強植物激素產生的能力，從而為植物生長提供所需的營養物質，直接影響植物的代謝過程[9]。當前學術界應用根際促生菌聯合超積累植物修復Cd 等重金屬污染土壤的研究較多，并取得很好的治理效果[10-11]。然而，有關根際微生物與植物聯合修復重金屬Zn 污染土壤的研究相對較少。本文通過鋅抗性菌株微紫青霉菌Penicillium janthinellum BC109-2對難溶態鋅的溶解能力和植物促生能力進行評價，并結合印度芥菜對鋅污染土壤進行修復效果研究，評價其潛在應用效果。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株及保存條件 本試驗選用本課題組從土壤中分離純化得到的鋅抗性菌株微紫青霉菌BC109-2（Genbank 登錄號：KX891188）作為實驗用菌株；菌株BC109-2 保存在含有5 mM ZnSO4·7H2O 的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基中。CAS：購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。印度芥菜種子：購自武漢安谷科技有限公司。

1.1.2 主要試劑和培養基 1-氨基環丙烷羧酸（ACC）和吲哚乙酸（IAA）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

金屬離子貯藏液：8.61 g ZnSO4·7H2O 溶于1 L超純水中制成30 mmol/L 的貯藏液，用0.22 μm 的濾膜過濾后保存在4 ℃冰箱中保存，實驗中經過滅菌后加入培養基中并使之達到所設計的濃度。

CAS 藍色檢測液按照文獻[12]的方法配制。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，超純水1 000 mL，自然pH，1×105Pa 滅菌20 min。PDB 培養基即為不加瓊脂的PDA 培養基。

DF 培養基按照文獻[13]的方法配制。在經過高溫滅菌的DF 液體培養基中，準確加入終濃度為3.0 mmol L-1 的ACC（1-氨基環丙烷-1-羧酸）即為ADF 培養基。

PKO 培養基[14]：葡萄糖10.0 g，（NH4）2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.036 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，Ca3（PO4）32.0 g，總體積1 000 mL，pH 7.0。

SA 液體培養基配方：蔗糖20.0 g，L-天門冬酰胺2.0 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g；pH 7.0。

1.2 實驗方法

1.2.1 鋅抗性菌株對難溶性鋅的溶解作用 將供試菌株轉接到含難溶性ZnCO3的PDB 培養基（1 000 mg/L ZnCO3）中，30 ℃，搖床振蕩培養72 h，每隔18 h 取一次樣，10 000 r/min 離心5 min，測定上清液中的鋅含量及溶液pH。

1.2.2 菌株BC109-2 的促生特性研究

1）檢測菌株利用氨基環丙烷羧酸（ACC）作為唯一氮源的能力。

將微生物菌株于含有不同濃度Zn2+（0，1，2，3 mmol/L）的ADF 培養基中，28 ℃培養24 h 誘導其產生ACC 脫氨酶，離心洗滌后破碎細胞得粗酶液，每個濃度做3 組重復試驗。菌株ACC 脫氨酶活性參照龔鳳娟和張宇鳳的方法[15]測定α-酮丁酸在540 nm處吸光度值。粗酶液中總蛋白質含量用考馬斯亮藍蛋白試劑盒測定。將每分鐘形成1 μmol α-丁酮酸的量定義為1 個酶活力單位。

2）吲哚乙酸（IAA）的產生能力測定。

將菌株接種到添加了0.5 mg/mL L-色氨酸以及不同濃度Zn2+（0，1，2，3 mmol/L）的PDB 液體培養基中28 ℃搖床震蕩培養48 h，每個濃度做3 組重復試驗[16]，對照組不接種菌株。取2 mL 菌液，10 000 r/min 離心15 min，準確移取2 mL Salkowski試劑[17]（0.5 mol/L FeCl3溶液10 mL、35%高氯酸500 mL，于使用前混合搖勻，避光保存）加入到1 mL 上清液中，于暗處顯色30 min，測定波長530 nm 處的吸光度值。配制純IAA 溶液（質量濃度梯度為0、7、14、21、28、35 ug/mL）測定對應波長下的吸光值，繪制標準曲線，計算不同Zn2+濃度下微生物的IAA 產生量。

3）鐵載體產生量測定。

菌株鐵載體產生量采用通用CAS 檢測法[18]測定。將新鮮菌種于限鐵SA 液體培養基中，28 ℃搖床培養（150 r/min）48 h，對照組接種相同量的死菌；菌懸液經10 000 r/min 離心15 min 取3 mL 上清液，將菌液和CAS 檢測液1∶1 的體積充分混勻，1 h 后測定630 nm 處的吸光度（A），另取3 mL 對照組的培養基上清液加入到3 mL CAS 藍色檢測液中，測得吸光值作為參比值（Ar），A/Ar的比值作為定量指標。

4）溶磷能力測定。

取1 mL 菌懸液接種于含有不同濃度Zn2+（0，1，2，3 mmol/L）的PKO 液體培養基中，置28 ℃搖床（150 r/min）振蕩培養48 h，以死菌菌懸液作為對照實驗，每個濃度做3 組重復試驗。采用鉬銻抗比色法[19-20]定量測定微紫青霉菌BC109-2 的溶磷能力，取2 mL 培養液1 500 r/min 離心后取上清液加入20 mL NaHCO3浸提劑及一勺無磷活性炭粉，搖床振蕩30 min 充分浸提，過濾后取10 mL 濾液加入35 mL 蒸餾水及5 mL 鉬銻抗試劑，混勻，室溫靜置30 min，測定700 nm 處吸光度。

1.2.3 根伸長實驗 將種子浸在乙醇∶30% H2O2（1∶1）溶液中消毒15 min，后用蒸餾水洗滌兩次。根伸長實驗根據Patten C L 所描述的方法[21]在濾紙上進行。菌種在含有0.5 mg/mL 色氨酸的LB 培養基中28 ℃，150 r/min 培養24 h，離心收集菌體后將0.1 mL OD600為0.2 的菌體培養液懸于9.9 mL 無菌生理鹽水中制成細胞懸液（約2.0×108CFU mL-1）加入濾紙上。放種子之前，不同濃度Zn2+以ZnSO4·7H2O形態（0，1，2，3 mmol/L）加到濾紙上。每天加水保持濾紙濕潤，室溫黑暗條件下培養5 d 后測量種子根伸長量。

1.2.4 印度芥菜與抗鋅菌株聯合修復鋅污染土壤試驗

1）土壤染毒處理。

供試土壤取自江蘇省無錫市15 cm 深的花園土，經過風干，研磨過2 mm 篩，然后121 ℃高壓滅菌鍋內滅菌15 min，土壤背景值如表1 所示。

土壤染毒處理根據文獻[11]操作。滅菌后的土壤風干后做5 種處理：分別外加0、2、4、8、16 mmol/kg ZnSO4·7H2O 溶液，攪拌混合均勻，放置約一個月，使金屬穩定，期間保持土壤濕潤，含水率在60%左右。

表1 花園土的理化性質Table 1 Physical and chemical properties of garden soil

2）盆栽試驗。

將印度芥菜種子浸在乙醇∶30% H2O2（1∶1）溶液中消毒15 min，后用蒸餾水洗滌兩次備用。試驗均采用外口直徑18 cm，內口直徑15.5 cm，高11 cm的花盆種植印度芥菜。每盆裝入處理后風干的土壤2 kg，播種前，每種濃度土壤做接種菌和不接種菌兩種處理，共10 種處理，每種處理做3 組重復，使形成106cfu/g 的土壤。每盆播種經過消毒處理的飽滿的印度芥菜種子10 粒，出苗后2、4、6 周再各接種一次相同濃度菌懸液，培養期間，用稀釋后的化肥施肥。生長8 周后收獲植物，洗滌干凈，分為根和莖兩部分，80 ℃條件下烘箱烘24 h 至恒重，酸4∶1（HNO3∶HClO4）消解后用火焰原子吸收法測鋅含量。結果表示為μg/g 植物干重。

1.2.5 數據統計與分析 用SPSS 23.0 軟件進行統計分析及差異顯著性檢驗，然后用origin 9.0 作圖。

2 結果與討論

2.1 鋅抗性菌株對難溶性鋅的溶解作用

根際微生物從土壤中和植物分泌物中獲取營養物質，并通過其自身的代謝產物，如有機酸、氨基酸等促進土壤重金屬的溶解[22]，提高土壤重金屬有效性，促進植物吸收和富集，從而減少土壤中的重金屬。

圖1 為鋅抗性菌株BC109-2 對難溶態重金屬的溶解性，可以看出菌株BC109-2 在培養18 h 時，培養基中可溶性鋅含量有所降低，可能是由于細胞對Zn 的吸附作用從而暫時降低了培養液中可溶性鋅含量；18 h 后隨著細胞數量的增多，菌株代謝能力增強，培養液中可溶性鋅含量逐漸增加；并在培養時間達到54～72 h 時，培養液中可溶性鋅含量增加的趨勢開始減緩。培養時間達到72 h 時，與接種滅活菌的對照組相比，接種菌株BC109-2 的培養液中可溶性鋅含量增加了213%，同時菌株BC109-2降低了培養液中的pH，由最初的7.0 下降到了5.7，文獻[23]也發現內生菌可以通過產有機酸酸化土壤環境，活化土壤中的重金屬，提高其生物有效性，從而促進植物對重金屬的提取效率。菌株BC109-2 的培養液pH 降低說明其對鋅的活化作用主要是由代謝產酸引起的，因此該菌株對難溶態鋅具有較強的溶解能力。

圖1 菌株BC109-2 對堿式碳酸鋅的促溶作用Fig.1 Solubilization of ZnCO3 by strain BC109-2

2.2 菌株BC109-2 的促生特性

大量研究結果表明，植物體內及根際土壤存在一些可以促進植物生長的促生菌，它們能夠產生促植物生長激素吲哚乙酸（IAA）[24]，1-氨基環丙烷-1-羧酸（ACC）脫氨酶和鐵載體等物質[25]，降低土壤中重金屬對植物的毒害作用，刺激植物根系的發育，促進植物的生長，從而增強植物對土壤中重金屬的富集效率[26]。

由表2 可知，菌株BC109-2 在不同鋅濃度下均具有ACC 脫氨酶活性，且隨著鋅濃度升高活力逐漸降低，培養基中無鋅存在時，酶活力最大為0.58 U/mg pro。該菌株具有分泌植物生長素的能力，但能夠產生生長素的量不大，其中在培養環境中鋅濃度為1 mmol/L 時產生量最大為1.504 mg/L。而文獻[27]篩選出的16 株菌株IAA 產量在0.78～30.48 mg/L之間，與已報道的產IAA 菌株相比，菌株BC109-2的產IAA 能力相對較弱。此外，菌株BC109-2 具有鐵載體產生能力，且在鋅濃度為0 的培養基中鐵載體產生能力達到2+水平。菌株BC109-2 在含有不同濃度鋅的PKO 培養基中溶磷能力差異較小，且在不含鋅的PKO 培養基中溶磷量達到最大值0.487 8 ug/mL。由此可見，鋅抗性菌株BC109-2 是一株能夠為植物提供礦質營養元素，同時能分泌植物激素、合成特異性酶的促生菌，其表現出的促生特性有可能促進印度芥菜根系的生長和植株的發育，為其聯合印度芥菜修復鋅污染土壤提供了依據。

表2 不同鋅濃度下菌株BC109-2 的促生特性Table 2 Promoting characteristics of the strain BC109-2 under different zinc concentrations

2.3 鋅抗性菌株對印度芥菜根伸長量的影響

在一般情況下，根伸長有助于提高植物富集土壤中重金屬的能力。根伸長量是植物根際促生菌（PGPR）的重要指標[28]。圖2 為不同鋅濃度下是否接種微生物菌株對印度芥菜種子5 d 的根伸長量的影響。在沒有接種菌株的情況下，隨著鋅濃度的不斷增加，培養5 d 后，印度芥菜種子根伸長量逐漸降低，表明重金屬鋅脅迫對植物生長有一定的抑制作用，且鋅濃度越高該抑制作用越強，這也與文獻[29]和文獻[30]的研究結果一致。

在接種根際促生菌BC109-2 后，與對照組相比，接種菌株BC109-2 的印度芥菜種子根伸長量在不同鋅濃度（0，1，2，3 mmol/L）下分別增加了9.3%、4.14%、44.83%和9.78%，這說明根際促生菌BC109-2 可以促進印度芥菜種子的根伸長量，并且在鋅污染的脅迫下該菌株也可以緩解鋅對印度芥菜根伸長的抑制作用。

鋅抗性菌株菌株BC109-2 在鋅污染脅迫下能夠產生IAA，而IAA 對誘導植物細胞的增殖與分化具有重要作用[31]，因而接種根際促生菌的印度芥菜種子的根伸長量比對照組明顯，這不僅可以提高印度芥菜對營養物質的吸收效率，也可以促進印度芥菜對土壤中重金屬鋅的富集與吸收。

圖2 不同鋅濃度下印度芥菜種子5 d 的根伸長量Fig.2 Root lengths of Indian mustard cultivated in the absence or presence of zinc at various concentrations after germination for 5 d

2.4 鋅抗性菌株BC109-2 聯合印度芥菜修復鋅污染土壤效果研究

采用溫室盆栽實驗觀察鋅抗性菌株BC109-2聯合印度芥菜修復鋅污染土壤的效果，結果如表3所示。結果顯示，5 組實驗接種根際促生菌的地上部分（莖）干重與對照組相比分別增加了14.89%、12.90%、10.17%、11.37%和32.26%，地下部分（根）則分別增加了18.18%、65.60%、3.77%、0.13%和44.24%，說明菌株BC109-2 能夠促進印度芥菜干生物量的增加。

不接種菌株BC109-2 時，印度芥菜富集土壤中重金屬鋅的結果顯示地上部分（莖）Zn 含量遠遠高于地下部分（根），說明印度芥菜富集的鋅大部分集中于地上部分。接種菌株后，印度芥菜地上部分和地下部分鋅含量均有不同程度增加，這可能是因為菌株BC109-2 使印度芥菜生物量有所增加，從而使印度芥菜增富集污染土壤中重金屬鋅的量增加[32]。

另外，接種根際促生菌BC109-2 之后，與未接種的對照組相比，接種了促生菌的整株印度芥菜所富集的鋅含量分別是對照組的1.10、1.24、1.02、1.16和1.14 倍，說明了菌株BC109-2 對提高印度芥菜富集土壤中的鋅有明顯的促進作用。一般來說，植物根際促生菌具有溶磷作用，能產生IAA 和鐵載體，具有ACC 脫氨酶活性，降低植株體內乙烯的生成，提高植物對鋅的抗逆性[33]。菌株BC109-2 的促生實驗和盆栽試驗結果也證明了該菌株能夠促進印度芥菜對鐵、磷的同化作用，促進印度芥菜的生物量增加和對土壤中鋅的富集。

表3 鋅污染土壤中印度芥菜生長實驗Table 3 Growth of Indian mustard planted in zinc-contaminated soil

3 結語

本研究對從土壤中篩選純化得到的鋅抗性菌株BC109-2 進行了促生特性研究，得出以下結論：1）在PDB 培養基（含1 000 mg/L ZnCO3）中培養72 h 后，菌株BC109-2 能使培養基上清液中鋅濃度增加了213%，培養液的pH 由初始的7.0 降低到5.7；說明該菌株對難溶態鋅具有較強的溶解能力，且該溶解性是由代謝產酸引起的；2）該菌株能產IAA 和鐵載體，并且具有ACC 脫氨酶活性和溶磷能力，充分表明菌株BC109-2 是一株根際促生菌；3）種子根伸長量實驗和盆栽試驗結果表明，根際促生菌BC109-2 能促進植物根系伸長，伸長率在4.14%～44.83%之間，同時使印度芥菜生物量得到不同程度的增加；4）盆栽實驗結果表明，接種根際促生菌BC109-2 的印度芥菜對土壤中鋅的富集量提升了1.02～1.24 倍不等，說明了根際促生菌BC109-2 可以增加印度芥菜提取土壤中鋅的效率。

根際促生菌BC109-2 促進植物吸收土壤中重金屬的機理還不清楚，對于根際微生物的作用機理以及重金屬生物有效性的影響因子等理論問題還有待進一步研究，從而為重金屬污染土壤的植物與微生物聯合修復研究提供理論支撐。