膀胱癌中Galectin-3的表達及其對膀胱癌細胞增殖、凋亡的影響

張廣云，張海芳，喬明洲

安陽市人民醫(yī)院泌尿外科 河南安陽 455000

近些年來，膀胱癌的發(fā)病率呈現(xiàn)出上升趨勢，且患者有較高的復(fù)發(fā)率和病死率[1]。膀胱癌的發(fā)生發(fā)展與癌基因的激活及抑癌基因的失活密切相關(guān)。半乳凝素(Galectin)-3是Galectins家族中研究最多的一員，主要定位于細胞質(zhì)，參與細胞生長、凋亡、周期調(diào)控、新生血管形成等過程[2]。多種人類腫瘤中Galectin-3呈現(xiàn)出過度表達，如肝癌、乳腺癌、肺癌，而其表達的抑制可抑制癌細胞的生長[3-5]。Galectin-3對膀胱癌細胞的影響目前尚未明確。本研究旨在探討Galectin-3對膀胱癌細胞增殖及凋亡的影響，并進一步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1標本來源收集2015年6月至2016年7月于安陽市人民醫(yī)院接受手術(shù)切除治療的膀胱癌患者組織標本54例，并取距腫瘤2 cm以上的癌旁正常組織作為對照組。患者中男35例，女19例，年齡46～80(62.2±11.2)歲。術(shù)前所有患者均未行放療及化療，樣本的采集均經(jīng)過患者、家屬的知情同意。

1.2主要試劑和儀器NC-siRNA、Galectin-3-siRNA購自上海生工生物工程有限公司；CCK8試劑盒購自日本Dojindo公司；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購自南京凱基公司；Galectin-3、Notch1、Hes1、Cleaved Caspase-3、PCNA和Ki-67單克隆抗體均購自美國Abcam公司；PCR劑盒購自日本TaKaRa公司；酶標儀購自Bio-Rad公司。

1.3細胞培養(yǎng)SV-HUC-1、BIU-87、T24和5637細胞在含有體積分數(shù)10%胎牛血清及青、鏈霉素雙抗的RPMI 1640細胞培養(yǎng)基中，于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2、95%飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.4Westernblot檢測Galectin-3、Notch1、Hes1、CleavedCaspase-3、PCNA和Ki-67的表達提取組織及細胞總蛋白。BCA法對總蛋白進行定量后用Western blot方法檢測蛋白含量，其過程依次為點樣、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育(Galectin-3、Notch1、Hes1、Cleaved Caspase-3、PCNA、Ki-67和內(nèi)參GAPDH，1∶1 000稀釋)、洗膜、孵育HRP標記的二抗(1∶1 000稀釋)、洗膜、ECL顯色、顯影、定影。采用Quantity One軟件分析目的蛋白及內(nèi)參GAPDH蛋白條帶灰度值，采用Image J軟件對蛋白灰度值進行量化，以目的蛋白與GAPDH蛋白的灰度值比值作為各蛋白的相對表達量。實驗重復(fù)3次。

1.5細胞轉(zhuǎn)染接種T24細胞至6孔板，每孔2 mL，細胞生長至80%～90%融合時進行轉(zhuǎn)染，細胞分為NC-siRNA組(用非特異性siRNA干預(yù)細胞)、Galectin-3-siRNA1和Galectin-3-siRNA2組(用Galectin-3-siRNA干預(yù)細胞)，未轉(zhuǎn)染任何siRNA的細胞作為對照組。方法參照Invitrogen 公司的Lipofectamine 2000說明。細胞轉(zhuǎn)染過程中使用無血清培養(yǎng)基，6 h后更換為正常的細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。實驗重復(fù)3次。

1.6Galectin-3siRNA轉(zhuǎn)染T24效果評價采用qRT-PCR及Western blot兩種方法。取轉(zhuǎn)染48 h的各組細胞，提取細胞中的總RNA，紫外分光光度儀檢測提取的RNA質(zhì)量，反轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA。Oligo6軟件設(shè)計Galectin-3及內(nèi)參GAPDH的PCR引物，由上海生工生物工程有限公司合成。Galectin-3引物序列：上游5’-GCCACTGATTGTGCCTTAT-3’，下游5’-CTCATTGAAGCGTGGGTTA-3’；GAPDH引物序列：上游5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。PCR擴增條件及程序參照PCR試劑盒。每個樣品重復(fù)6次，根據(jù)所得Ct值，采用2-ΔΔCt法計算Galectin-3 mRNA的相對表達量。實驗重復(fù)3次。

1.7細胞增殖檢測收集轉(zhuǎn)染Galectin-3-siRNA 12、24、48 h的T24細胞，同時設(shè)對照組和NC-siRNA組，加CCK-8試劑10 μL于每孔中，常規(guī)孵育4 h，490 nm波長處采用酶標儀測定吸光度(A)值。每組設(shè)置5個復(fù)孔，計算細胞存活率。細胞存活率=(轉(zhuǎn)染組細胞A值/對照組細胞A值)×100%。實驗重復(fù)3次。

1.8細胞凋亡檢測收集轉(zhuǎn)染Galectin-3-siRNA 48 h的T24細胞，同時設(shè)對照組和NC-siRNA組，PBS洗滌及結(jié)合緩沖液重懸后，分別加Annexin-V-FITC 5 μL和PI 10 μL，避光室溫條件下靜置20 min，上機前再加400 μL結(jié)合緩沖液，1 h內(nèi)采用流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡情況。實驗重復(fù)3次。

1.9統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 21.0進行數(shù)據(jù)分析。膀胱癌組織及癌旁正常組織Galectin-3相對表達量的比較采用配對t檢驗；各組間Galectin-3 siRNA轉(zhuǎn)染效果，細胞存活率，凋亡率及Notch1、Hes1、PCNA、Ki-67和Cleaved Caspase-3相對表達量的比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1膀胱癌組織及細胞中Galectin-3蛋白的表達膀胱癌組織中Galectin-3蛋白的表達(0.389±0.042)高于癌旁正常組織(0.053±0.006)(t配對=16.937，P<0.001)。以人膀胱上皮永生化細胞SV-HUC-1作為對照，檢測膀胱癌T24、5637、BIU-87細胞中Galectin-3的表達，結(jié)果顯示T24、5637、BIU-87細胞中Galectin-3的表達水平均高于SV-HUC-1細胞中的表達，T24細胞中Galectin-3的表達水平最高，選擇該細胞用于后續(xù)研究。見圖1、表1。

1：癌旁正常組織；2：膀胱癌組織；3：SV-HUC-1細胞；4：T24細胞；5：5637細胞；6：BIU-87細胞

圖1 Galectin-3在膀胱癌組織(A)及細胞(B)中的表達

F=120.603，P<0.001；*：與SV-HUC-1細胞比較，P<0.05

2.2轉(zhuǎn)染后T24細胞中Galectin-3的表達結(jié)果見圖2、表2。可知，與對照組比較，NC-siRNA組Galectin-3 mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義；Galectin-3-siRNA1組和Galectin-3-siRNA2組與對照組比較，Galectin-3 mRNA表達降低，Galectin-3-siRNA1組的抑制效果更明顯，用于后續(xù)研究。

1：對照組；2：NC-siRNA組；3：Galectin-3-siRNA1組；4：Galectin-3-siRNA2組

圖2 Galectin-3 siRNA轉(zhuǎn)染后T24細胞中Galectin-3蛋白的表達

F=46.916，P<0.001；*：與對照組、NC-siRNA組比較，P<0.05

2.3抑制Galectin-3表達對細胞增殖的影響結(jié)果見表3。可知，Galectin-3-siRNA組細胞在12、24和48 h的存活率均低于對照組。

表3 各組細胞存活率的比較(n=3) %

*：與對照組、NC-siRNA組比較，P<0.05

2.4抑制Galectin-3表達對細胞凋亡的影響各組細胞凋亡率見表4。可知，Galectin-3-siRNA組細胞凋亡率高于對照組和NC-siRNA組。

表4 各組細胞凋亡率的比較 %

F=333.007，P<0.001；*：與對照組、NC-siRNA組比較，P<0.05

2.5抑制Galectin-3表達對Notch1信號及相關(guān)蛋白表達的影響結(jié)果見表5和圖3。可知，Galectin-3-siRNA組Notch1、Hes1、PCNA和Ki-67表達低于對照組，Cleaved Caspase-3表達高于對照組。

表5 各組細胞Ki-67、PCNA、Cleaved Caspase-3、Notch1和Hes1蛋白表達的比較(n=3)

*：與對照組、NC-siRNA組比較，P<0.05

1：對照組；2：NC-siRNA組；3：Galectin-3-siRNA組

3 討論

Galectin-3是目前認為與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的基因。Galectin-3定位于人類染色體14q21-22，可通過糖識別區(qū)域與細胞外基質(zhì)蛋白、細胞表面分子、細胞內(nèi)糖蛋白相互作用，從而參與細胞的增殖、凋亡及腫瘤進展等過程[6]。細胞中Galectin-3的大量表達可通過調(diào)節(jié)細胞生長而加快細胞增殖[7]。目前的研究[8]發(fā)現(xiàn)，Galectin-3在卵巢癌、惡性黑色素瘤等多種腫瘤中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)。本研究也檢測到Galectin-3在膀胱癌組織及細胞中有高表達。

RNA干擾是由雙鏈RNA介導(dǎo)的特異性同源靶基因轉(zhuǎn)錄后發(fā)生沉默的現(xiàn)象，可通過抑制細胞增殖、促進細胞凋亡，從而達到治療的目的[9]。研究[10]顯示，RNA干擾技術(shù)抑制大腸癌細胞中Galectin-3的表達后可使癌細胞增殖減慢，凋亡增加。惡性膠質(zhì)瘤細胞中Galectin-3呈現(xiàn)高表達，轉(zhuǎn)染siRNA可降低Galectin-3的表達，且Galectin-3表達的抑制可明顯降低細胞的增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡[11]。Ki-67位于人類基因10q25，是反映細胞增殖活性的關(guān)鍵指標[12]。PCNA的表達可影響細胞的增殖、生長、侵襲及DNA合成，是細胞增殖活性檢測的一個有效標志物[13]。Caspase-3是Caspase家族的成員之一，其活化可誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡[14]。目前Ki-67、PCNA、Caspase-3等的作用已在膀胱癌中得到證實[15]。有研究[16]顯示，Galectin-3表達可調(diào)節(jié)癌細胞Ki-67、PCNA、Caspase-3表達，從而影響癌細胞生長。本研究結(jié)果顯示，膀胱癌細胞中Galectin-3表達抑制對癌細胞增殖有抑制作用，且可誘導(dǎo)細胞凋亡、下調(diào)PCNA、Ki-67表達，上調(diào)Cleaved Caspase-3表達。

Notch信號由Notch受體、Notch配體、Notch調(diào)節(jié)分子、DNA結(jié)合蛋白、細胞內(nèi)效應(yīng)分子等組成，在許多器官及組織的正常生長發(fā)育過程中有關(guān)鍵作用，可通過一系列過程激活下游一些靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮生物學(xué)作用[17-18]。研究[19-21]表明，多種人類腫瘤中Notch信號通路處于激活狀態(tài)，如膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌等。Galectin-3可調(diào)控Notch信號通路，影響腫瘤細胞生長[22]。本研究結(jié)果顯示，膀胱癌細胞中Galectin-3表達抑制可下調(diào)Notch1及Hes1表達。

綜上所述，抑制膀胱癌中Galectin-3表達可明顯降低細胞活力，誘導(dǎo)細胞凋亡，其機制可能與Notch信號的下調(diào)有關(guān)。該研究結(jié)果提示Galectin-3可能是膀胱癌診療的有效靶點，但還需更多研究證實。