當歸對氧化應激損傷的大鼠髓核細胞增殖和胞外基質合成的影響

王新立，劉汝銀，王西彬，岳宗進

河南省中醫院脊柱科 鄭州 450000

下腰痛是臨床上的常見病，嚴重威脅人類健康[1]。研究[2]顯示半數以上的下腰痛由椎間盤退行性病變造成。當椎間盤發生退行性病變時，髓核中的胞外基質降解且不能及時更新，導致椎間盤的生物力學特性發生變化，進而影響脊柱的穩定性[3]。研究[4]發現多種因素與椎間盤退行性病變的發生發展相關，如氧化應激、炎癥和抽煙等。當歸是一種常見中藥，具有明顯的抗炎和抗氧化活性[5-6]。研究[7]顯示當歸用于治療腰椎間盤突出癥療效顯著，且當歸能夠抑制髓核細胞的凋亡和自噬。但是當歸對髓核細胞增殖和細胞外基質合成的作用尚未見相關研究。因此我們使用H2O2處理體外培養的大鼠髓核細胞，模擬氧化應激環境，探究當歸對氧化應激損傷的髓核細胞增殖和胞外基質合成的影響和可能機制。

1 材料與方法

1.1材料大鼠椎間盤髓核細胞由本實驗室保存，具體分離方法見文獻[7]。當歸注射液購于雅安三九藥業有限公司，DMEM/F12培養基購于美國Thermo Fisher公司，胎牛血清、胰蛋白酶和青/鏈霉素雙抗溶液均購于美國Gibco公司，MTT試劑盒和RIPA裂解液購于上海碧云天生物技術公司，H2O2溶液購于美國Sigma公司，RNAiso Plus購于大連寶生物有限公司，反轉錄試劑盒和UltraSYBR Mixture(with ROX Ⅰ)購于北京康為世紀有限公司，Easy Ⅱ Protein Quantitative Kit(BCA)購于北京全式金生物科技有限公司，增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、細胞周期蛋白(Cyclin)D1、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)3和c-Myc抗體均購于美國Cell Signaling Technology公司，蛋白聚糖(Aggrecan)抗體購于美國Santa Cruz公司，Ⅱ型膠原(Collagen Ⅱ)、MMP9、β-catenin及β-actin抗體均購于美國Abcam公司。

1.2細胞培養和分組處于對數生長期的髓核細胞經胰蛋白酶消化后接種于含體積分數10%胎牛血清、青/鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養基中，在37 ℃，體積分數5%CO2的細胞培養箱中培養24 h。實驗分為對照組(不加任何干預)、H2O2組(加入400 μmol/L的H2O2刺激6 h)、H2O2+當歸組(先加入1 g/L當歸溶液培養24 h，然后加入400 μmol/L的H2O2刺激6 h)。

1.3細胞活力檢測收集分組處理的髓核細胞，使用MTT試劑盒檢測細胞活力。每孔加入10 μL 5 g/L的MTT溶液，在細胞培養箱中孵育4 h，然后每孔加入100 μL Formazan溶解液，充分混勻后繼續培養，直至紫色結晶全部溶解。在570 nm波長處，使用酶標儀檢測吸光度值，代表細胞活力。實驗重復3次，下同。

1.4PCNA和CyclinD1蛋白表達的檢測采用Western blot法。收集分組處理的髓核細胞，用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，用BCA法檢測其濃度。取40 μg總蛋白，沸水浴煮沸變性后進行SDS-PAGE電泳，分離蛋白。電泳后將蛋白轉移到PVDF膜上，加入50 g/L脫脂奶粉溶液封閉2 h后，加入一抗(PCNA和CyclinD1抗體，均按1∶1 000稀釋)，4 ℃過夜孵育，1×TBST充分洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h，洗膜后，將ECL發光液均勻加至膜上，拍照，以β-actin為內參進行灰度值分析。

1.5Aggrecan、CollagenⅡ、MMP3和MMP9mRNA表達的檢測按照RNAiso Plus試劑說明書操作，提取各組細胞的總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，用NanoDrop2000檢測RNA的濃度和純度。使用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA，然后按照UltraSYBR Mixture說明書加入各試劑，進行Real-time PCR操作。反應體系：UltraSYBR Mixture 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。 反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸1 min，40個循環。以GAPDH為內參，使用公式2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6Aggrecan、CollagenⅡ、MMP3、MMP9蛋白及β-catenin、c-Myc蛋白表達的檢測采用Western blot法。方法同1.4，其中Aggrecan、MMP3、c-Myc抗體稀釋度均為1∶1 000，Collagen Ⅱ、MMP9、β-catenin抗體稀釋度分別為1∶500、1∶800、1∶1 200。

1.7統計學處理用SPSS 13.0處理數據。采用單因素方差分析比較3組以上各指標的差異，兩兩比較用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1各組細胞活力、PCNA和CyclinD1蛋白的表達與對照組相比，H2O2組細胞活力降低，PCNA和CyclinD1蛋白表達水平降低；與H2O2組相比，H2O2+當歸組細胞活力增加，PCNA和CyclinD1蛋白表達水平升高。見圖1、表2。

1、2、3：分別為對照組、H2O2組、H2O2+當歸組

組別細胞活力/%PCNACyclinD1對照組103.333±10.0331.328±0.1281.068±0.089H2O2組49.167±10.722*0.410±0.093*0.156±0.069*H2O2+當歸組87.833±9.745#0.920±0.084*#0.606±0.107*#F45.100 119.614 128.734 P<0.001 <0.001 <0.001

*:與對照組比較，P<0.05; #:與H2O2組比較，P<0.05

2.2各組細胞Aggrecan、CollagenⅡ、MMP3和MMP9mRNA及蛋白的表達與對照組相比，H2O2組Aggrecan和Collagen Ⅱ mRNA和蛋白表達水平降低,MMP3和MMP9 mRNA和蛋白表達水平升高；當歸可部分逆轉H2O2引起的變化。見表3、圖2、表4。

表3 各組細胞Aggrecan、Collagen Ⅱ、MMP3和MMP9 mRNA的表達(n=3)

*:與對照組比較，P<0.05; #:與H2O2組比較，P<0.05

1、2、3：分別為對照組、H2O2組、H2O2+當歸組

組別AggrecanCollagen ⅡMMP3MMP9對照組1.353±0.0651.007±0.1030.050±0.0300.110±0.036H2O2組0.400±0.110*0.367±0.129*1.710±0.115*1.143±0.090*H2O2+當歸組0.973±0.097*#0.827±0.087#0.930±0.088*#0.643±0.131*#F80.450 28.172 280.887 90.806 P<0.001 0.001 <0.001 <0.001

*:與對照組比較，P<0.05; #:與H2O2組比較，P<0.05

2.3各組細胞β-catenin和c-Myc蛋白的表達與對照組相比，H2O2組β-catenin和c-Myc蛋白表達水平升高；與H2O2組相比，H2O2+當歸組β-catenin和c-Myc蛋白表達水平降低。見圖3和表5。

1、2、3：分別為對照組、H2O2組、H2O2+當歸組

組別β-cateninc-Myc對照組0.053±0.0350.410±0.095H2O2組0.987±0.100*1.267±0.139*H2O2+當歸組0.520±0.090*#0.620±0.090#F101.205 49.247 P<0.001 <0.001

*:與對照組比較，P<0.05; #:與H2O2組比較，P<0.05

3 討論

由增殖降低引起的基質產生細胞的減少是椎間盤退行性病變的一個重要因素[8]。PCNA和CyclinD1是兩個重要的細胞增殖標志物[9]。本研究中H2O2刺激抑制了髓核細胞的活力，降低了PCNA和CyclinD1的表達。當歸預處理明顯增加了H2O2刺激的髓核細胞的活力，上調了PCNA和CyclinD1的表達，表明當歸能夠促進氧化損傷的髓核細胞增殖。

研究[10]顯示，椎間盤中胞外基質的組成對于其功能的維持至關重要，胞外基質的降解會導致椎間盤高度的減小以及血管和神經數目的減少。髓核細胞負責椎間盤中胞外基質的合成和調控，控制胞外基質合成與降解的平衡。髓核細胞分泌的胞外基質主要為Aggrecan和Collagen Ⅱ。MMPs能夠介導基質的降解過程，在椎間盤退行性病變中MMP1、MMP3、MMP7、MMP9和MMP13的表達和活性均增加[10]。此外，研究[11-12]發現在髓核細胞中MMPs表達上調會引起Aggrecan和Collagen Ⅱ含量的下降。因此，本研究使用H2O2誘導髓核細胞的氧化應激損傷，探究當歸對髓核細胞中胞外基質合成的影響和分子機制。結果顯示，與對照組相比，H2O2處理后髓核細胞中Aggrecan和Collagen Ⅱ的表達均下調，而MMP3和MMP9的表達均上調。這表明H2O2抑制了髓核細胞胞外基質的合成，促進了其降解，與之前的研究[13]結果相一致。與H2O2組相比，當歸預處理增加了Aggrecan和Collagen Ⅱ的表達，下調了MMP3和MMP9的表達，這表明當歸能夠促進髓核細胞中胞外基質的合成，減少其降解。

Wnt/β-catenin通路的活化與椎間盤退行性疾病的發展密切相關。該通路能夠加速髓核細胞的衰老，誘導MMPs的表達，促進胞外基質的降解[14]。c-Myc是Wnt/β-catenin通路下游的一個重要靶基因[15]。本研究結果顯示，H2O2刺激后髓核細胞β-catenin和c-Myc的表達水平均增加，而使用當歸預處理后髓核細胞β-catenin和c-Myc的表達水平均降低，提示當歸可能通過抑制Wnt/β-catenin通路促進髓核細胞的增殖和胞外基質的合成。