MetaCCA在多元表型與基因型相關(guān)分析中的應(yīng)用

賈曉燦，楊永利，王 威，施學(xué)忠

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與職業(yè)病學(xué)教研室 鄭州 450001

過去十幾年，全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study, GWAS)在識(shí)別疾病的常見變異方面取得了巨大進(jìn)展，但越來越多的研究[1-2]結(jié)果表明罕見變異在復(fù)雜疾病的發(fā)生發(fā)展中同樣起著很大作用。單位點(diǎn)分析的GWAS忽略了不同表型之間的相關(guān)信息，因此不能有效識(shí)別復(fù)雜疾病中的罕見變異。MetaCCA也稱Summary statistics-based multivariate meta-analysis of genome-wide association studies using canonical correlation analysis[3]，是利用典型相關(guān)分析(canonical correlation analysis, CCA)的原理，對(duì)GWAS的匯總統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行分析，以探討多個(gè)疾病表型與基因型之間的關(guān)系，從而為研究疾病的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)[3-6]。該文將重點(diǎn)介紹metaCCA的原理和實(shí)現(xiàn)，并探討其在多元表型與基因型相關(guān)分析中的應(yīng)用前景。

1 MetaCCA簡(jiǎn)介

1.1MetaCCA的提出2005年Klein等[7]在Science雜志上首次報(bào)道了視網(wǎng)膜黃色雀斑的GWAS結(jié)果，并發(fā)現(xiàn)一個(gè)與視網(wǎng)膜黃色雀斑有顯著關(guān)聯(lián)的基因。此后，一系列針對(duì)人類復(fù)雜疾病或性狀的GWAS相繼開展，在肥胖、高血壓、高血脂、心血管系統(tǒng)疾病、腫瘤、神經(jīng)精神類疾病等諸多疾病方面取得了突飛猛進(jìn)的研究成果[8-10]。GWAS逐漸成為識(shí)別疾病遺傳變異最常用的方法，為眾多疾病的基因診斷及個(gè)體化治療提供了理論基礎(chǔ)。

GWAS是一種單因素分析方法，它只能分析一個(gè)單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotide polymorphism，SNP)與一個(gè)表型之間的關(guān)系，忽略了多個(gè)SNP之間的內(nèi)部關(guān)聯(lián)性以及復(fù)雜疾病中多個(gè)表型之間的相關(guān)性，因此檢驗(yàn)效能有限[11-12]。隨著海量測(cè)序數(shù)據(jù)、基因表達(dá)數(shù)據(jù)、多維數(shù)據(jù)以及多元表型復(fù)雜疾病的出現(xiàn)，GWAS的局限性也越來越凸顯。此外，GWAS分析的數(shù)據(jù)需要具體到個(gè)體水平上，由于個(gè)體水平上的測(cè)序成本高而且數(shù)據(jù)需保密，因此目前僅有部分GWAS的匯總結(jié)果得以公開。如何基于公開發(fā)表的GWAS匯總統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)庫(kù)識(shí)別復(fù)雜疾病中的罕見變異，已成為目前基因組學(xué)研究面臨的主要問題[13]。2015年，Cichonska等[3]首次在《Bioinformatics》雜志上提出metaCCA的方法。CCA是一種分別提取自變量集與因變量集的最大主成分，通過兩個(gè)主成分的相關(guān)關(guān)系推測(cè)自變量集與因變量集之間的相關(guān)關(guān)系的方法[14]。MetaCCA是對(duì)公開發(fā)表的GWAS的匯總結(jié)果進(jìn)行整理，利用傳統(tǒng)統(tǒng)計(jì)方法CCA，檢測(cè)多個(gè)SNP與多個(gè)疾病表型之間的關(guān)系。

1.2MetaCCA的優(yōu)點(diǎn)與傳統(tǒng)的GWAS相比，metaCCA有如下優(yōu)點(diǎn)。首先，metaCCA將多個(gè)GWAS結(jié)果匯總在一起，增大了樣本量，提高了檢驗(yàn)效能。其次，metaCCA利用的是已公開發(fā)表的GWSA數(shù)據(jù)，不需要個(gè)體水平上的測(cè)序，是一個(gè)成本-效益較高的方法。最后，metaCCA借助于CCA的原理，既考慮到了基因型之間的內(nèi)部關(guān)聯(lián)性，又考慮到了疾病表型之間的相關(guān)性。而傳統(tǒng)的檢驗(yàn)多元表型與基因型相關(guān)性的方法是逐個(gè)對(duì)表型單之間與基因關(guān)聯(lián)性進(jìn)行檢驗(yàn)，然后采用多重檢驗(yàn)校正。然而同一疾病的多元表型之間往往具有相關(guān)性，基于單個(gè)表型與基因型的關(guān)聯(lián)性分析難以全面揭示遺傳與復(fù)雜疾病的聯(lián)系[15]。利用多元表型變量間的相關(guān)性，從多元表型變量中提取類似主成分因子的策略進(jìn)行相關(guān)分析，是識(shí)別復(fù)雜疾病中罕見變異的有效方法[16]。

2 模型建立與實(shí)現(xiàn)

①∑XY由單個(gè)SNP與單個(gè)表型變量的回歸系數(shù)β的矩陣組成，β可由單變量GWAS的匯總統(tǒng)計(jì)結(jié)果獲得，其表達(dá)式為:

式(2)中，g為基因型變量個(gè)數(shù)，一般為SNP個(gè)數(shù)；p為表型變量個(gè)數(shù)。

需要注意的是，X和Y應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換后才可以帶入計(jì)算，其標(biāo)準(zhǔn)化公式為：

式(3)中，N為樣本量，SEgp為βgp的標(biāo)準(zhǔn)誤，也可以由單變量的GWAS匯總統(tǒng)計(jì)結(jié)果獲得。

經(jīng)過以上步驟可得出總協(xié)方差矩陣，在將此協(xié)方差導(dǎo)入CCA模型之前，需要先判斷總協(xié)方差矩陣是否為半正定矩陣(positive semidefinite，PSD)。當(dāng)不滿足PSD時(shí)，需要使用迭代方法對(duì)矩陣進(jìn)行降維，直至滿足PSD。此后，將總協(xié)方差矩陣進(jìn)行CCA，計(jì)算基因型與表型之間的典型相關(guān)系數(shù)r：

2.3軟件實(shí)現(xiàn)及程序包MetaCCA主要通過Plink軟件(http://zzz.bwh.harvard.edu/plink/download.shtml)及R中的metaCCA包(https://github.com/MoisesExpositoAlonso/metaCCA)實(shí)現(xiàn)。假設(shè)將原始GWAS匯總統(tǒng)計(jì)結(jié)果整理后得到一個(gè)樣本量為n、含1 000個(gè)SNP和10個(gè)性狀的數(shù)據(jù)集S_XY_full_study，則metaCCA的軟件實(shí)現(xiàn)過程如下：

plink2 --file hapmap3 --extract SNP_id --keep CEU_hapmap --r2 inter-chr with-freqs --ld-window-r2 0 --make-bed --out uppro

S_YY=estimateSyy(S_XY=S_XY_full_study)

輸出結(jié)果為10×10的相關(guān)系數(shù)矩陣。

③利用metaCCA包中的metaCcaGp函數(shù)進(jìn)行單個(gè)SNP(以rs123為例)與10個(gè)表型之間的相關(guān)分析，輸入數(shù)據(jù)為S_XY_full_study,代碼為：

result=metaCcaGp( nr_studies=1),

S_XY=list(S_XY_full_study),

std_info=0,

S_YY=list(estimateSyy(S_XY_full_study)),

N=n,

analysis_type=1,

SNP_id=(′rs123′)

輸出結(jié)果有三列，分別為“rs123”“典型相關(guān)系數(shù)r”和“-Log10P”

④假設(shè)rs123、rs125和rs127分布在基因A上，利用metaCCA包中的metaCcaGp函數(shù)進(jìn)行基因A與10個(gè)表型之間的相關(guān)分析。輸入數(shù)據(jù)為S_XX_study和S_XY_full_study,代碼為：

result=metaCcaGp(nr_studies=1),

S_XY=list(S_XY_full_study),

std_info=0,

S_YY=list(estimateSyy(S_XY_full_study)),

N=n,

analysis_type=2,

SNP_id=c(′rs123′,′125′,′rs127′),

S_XX=list(S_XX_study)

輸出結(jié)果有3列，分別為“rs123、rs125和rs127”(即基因A)、“典型相關(guān)系數(shù)r”和“-Log10P”。

3 MetaCCA在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

3.1血脂水平相關(guān)基因的識(shí)別Cichonska等[3]利用3個(gè)芬蘭人群9個(gè)血脂表型的數(shù)據(jù)進(jìn)行了metaCCA分析并與個(gè)體水平上的GWAS和CCA結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，納入的SNP有455 521個(gè)。與單變量GWAS結(jié)果相比，metaCCA的檢驗(yàn)效能較高。比如GWAS結(jié)果顯示USP1/DOCK7和FCGR2A/3A/2C/3B兩個(gè)區(qū)域的SNP與血脂水平相關(guān)(P<5×10-8)；通過metaCCA進(jìn)一步驗(yàn)證了此結(jié)果，而且發(fā)現(xiàn)了位于PCSK9/BSND、CELSR2和GALNT2基因區(qū)域的位點(diǎn)?；蛩缴系姆治鲞x擇了5個(gè)基因，包括APOE、CETP、GCKR、PCSK9和NOD2，其中APOE、CETP、GCKR和 PCSK9已經(jīng)被之前的研究證實(shí)和血脂水平相關(guān)，而NOD2未見報(bào)道。與個(gè)體水平上的CCA相比，metaCCA的結(jié)果比較準(zhǔn)確，所選擇的5個(gè)基因中，有4個(gè)基因結(jié)果的絕對(duì)誤差不超過0.2。

3.2精神疾病共有風(fēng)險(xiǎn)基因的識(shí)別精神疾病是一類以感知和認(rèn)知障礙導(dǎo)致行為、意志和情緒異常的復(fù)雜疾病。常見的精神疾病有精神分裂癥、雙相情感障礙、抑郁癥、孤獨(dú)癥和注意缺陷多動(dòng)癥[18]。從血液樣品中抽提出患者全基因組DNA，使用群體遺傳學(xué)知識(shí)和統(tǒng)計(jì)推斷技術(shù)尋找與疾病相關(guān)的遺傳變異，是研究復(fù)雜精神疾病遺傳變異的主要途徑[19]。已有的GWAS和生物通路分析均顯示這幾種常見精神疾病之間存在共有的遺傳風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)和生物路徑[20-21]。本課題組[22-23]利用metaCCA對(duì)美國(guó)精神病學(xué)基因組學(xué)聯(lián)盟(Psychiatric Genomics Consortium，PGC，網(wǎng)址: http://www.med.unc.edu/pgc/)的數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，共發(fā)現(xiàn)37個(gè)多態(tài)性基因，其中13個(gè)已被報(bào)道與多種精神疾病相關(guān)，4個(gè)被報(bào)道僅與一種精神疾病相關(guān)，另有20個(gè)為新發(fā)現(xiàn)的基因。此外，基因功能富集分析結(jié)果顯示，這37個(gè)基因與黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合、電壓門控鈣通路等多個(gè)路徑相關(guān)。這些被發(fā)現(xiàn)的基因?yàn)榫窦膊〉陌l(fā)病機(jī)制研究提供了線索。

4 MetaCCA的局限和挑戰(zhàn)

MetaCCA在多元表型與基因型數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析方面的應(yīng)用，很大程度上增強(qiáng)了人們對(duì)復(fù)雜疾病遺傳機(jī)制的理解，對(duì)于復(fù)雜疾病的預(yù)防、治療有較大的實(shí)際意義，但是，也存在一定的局限性。首先，metaCCA主要依賴統(tǒng)計(jì)分析，因此可能會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果，尤其是在基因和通路水平上，容易出現(xiàn)某個(gè)SNP和多個(gè)表型強(qiáng)相關(guān)而導(dǎo)致該SNP所在的基因或通路有意義，此時(shí)就需要其他基因水平的統(tǒng)計(jì)方法或多元統(tǒng)計(jì)方法對(duì)metaCCA的結(jié)果進(jìn)行篩選，或者結(jié)合基因功能分析結(jié)果綜合下結(jié)論。其次，metaCCA需要將多個(gè)GWAS結(jié)果整合在一起，而原有的GWAS選取的參照數(shù)據(jù)庫(kù)模板、最小等位基因頻率等處理因素可能不同，在數(shù)據(jù)篩選過程中，需控制或降低這些混雜因素的影響以及避免幾個(gè)研究之間樣本的重復(fù)。再次，metaCCA的核心思想是CCA，而CCA在納入變量時(shí)需要對(duì)原始變量進(jìn)行篩選，當(dāng)同一組內(nèi)的變量存在較強(qiáng)相關(guān)關(guān)系時(shí)，一般建議刪除其中一個(gè)變量或?qū)⒆兞亢喜?，以得到更加合理的模型。因此，?duì)于metaCCA納入的基因型變量應(yīng)通過連鎖不平衡或線性模型等方法進(jìn)行篩選；對(duì)于表型變量，不僅要考慮臨床癥狀的相似性、生物路徑的相同性，還要考慮各變量之間相關(guān)性的強(qiáng)弱。最后，metaCCA的結(jié)果只能表明基因型與表型之間有無統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)，其生物學(xué)機(jī)制還需實(shí)驗(yàn)研究來證實(shí)。

5 小結(jié)

目前，對(duì)于metaCCA的研究雖處于起步階段，但已經(jīng)為人類復(fù)雜性遺傳疾病以及高維數(shù)據(jù)的研究打開了一扇大門。該方法具有高通量、低成本、不涉及候選基因等優(yōu)點(diǎn)，是目前分析多元表型與基因型相關(guān)關(guān)系的有效途徑，也可應(yīng)用于基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等方面的研究，從而為人類了解復(fù)雜性疾病的發(fā)病機(jī)制提供更多的線索，但其理論和方法還需在應(yīng)用中進(jìn)一步完善。