紫草素納米結構脂質載體制備與質量評價研究

史 凡, 楊 紅

(首都醫科大學 燕京醫學院, 北京 100069)

紫草素(Shikonin,SN)是從傳統中藥紫草中提取的一類萘醌類化合物,具有抗炎、鎮痛作用、抗病毒和抗菌作用、抗腫瘤、抑制脂肪生成等作用[1-2],其廣泛的藥理與臨床作用日益受到人們的重視。目前,國內外對紫草中化學成分、藥理作用、提取工藝的研究較全面和深入[3-4],對紫草素在動物體內的吸收特性也有了一定研究[5-6]。而針對制劑方面的研究還不夠完善,僅有脂質體、微乳等方面的初步研究報道[7-8]。臨床應用的制劑通常存在釋藥不規則、質量不穩定等諸多不足,尚不足以解決紫草素在水溶液中溶解度極低,毒性大且缺乏選擇性[9]的問題。

納米結構脂質載體(nanostructured lipid carriers, NLC)是在固體脂質納米粒的基礎上發展起來的一種新型的藥物納米載體,是由幾種不同結構、互不混溶的固液脂質構成的一種具有特殊結構的脂質填充體系[10-11]。目前國內外對納米結構脂質載體的研究技術較為成熟[12-13],已充分證實可提高難溶性藥物的溶解度,促進藥物的充分溶解[14],促進藥物在胃腸道的吸收[15]。目前專門針對紫草素的納米結構脂質載體的制備研究尚未開展。本實驗擬設計制備載有紫草素的納米結構脂質載體(SN-NLC),對其理化性質與體外釋放進行測定及評價,為后期的進一步研究奠定基礎。

1 儀器與材料

儀器:高壓乳勻機(GEA, Niro Soavi S.P.A., Italy),透射電子顯微鏡(JEM-1230, JEOL, Japan),紫外可見分光光度儀(UV-762上海精密科學儀器有限公司),分析天平(BS124S Sartoriusd=0.0001),恒溫磁力攪拌器(S21-2 上海司樂儀器有限公司),激光納米粒度儀(BROOKHABEN Instruments Corporation),KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),振蕩搖床(Forma Orbital Shaker,Thermo),透析袋(Solarbio,Mw=7000)等。

材料:紫草素(中國食品藥品檢定研究所),單硬脂酸甘油酯、中碳鏈三甘酯(天津市光復精細化工研究所),吐溫-80(中國國藥集團化學試劑有限公司),各種無機鹽和有機溶劑均為分析純。

2 實驗方法

2.1 紫草素納米結構脂質載體的制備

紫草素納米結構脂質載體由高壓乳勻法制備。首先稱取處方量的固相脂質單硬脂酸甘油酯和液相脂質中碳鏈三甘酯于茄形瓶中,水浴加熱,待固液相脂質熔融后,攪拌下滴加入紫草素的乙醇溶液；同時稱取處方量的吐溫-80攪拌分散于磷酸鹽(pH7.4)緩沖溶液中,攪拌下,滴入熔融的固液脂質中,繼續攪拌制得預乳化液；同溫(1.0～1.2)×108Pa下采用高壓乳勻機循環乳勻5次,室溫冷卻后得到紫草素納米結構脂質載體。

2.2 粒徑分布、Zeta電位測定方法及形態學觀察

納米結構脂質載體粒徑分布和Zeta電位由激光納米粒度分析儀測量,其中粒徑采用強度分布(Intensity distribution)的結果,多分散性指數(Polydispersity Index, PI)采用單峰分布(unimodal distribution) 的結果。粒徑和Zeta電位均測定3次,取平均值。

采用透射電鏡觀察納米結構脂質載體的微觀形態。取樣品溶液,用蒸餾水稀釋,取10 μL置于銅網表面,下襯濾紙,空氣中自然揮干后,于電鏡下觀察。固定電鏡電子束電壓為80 kV,移動坐標,調節放大倍數,尋找觀察粒子并拍照。

2.3 納米結構脂質載體中紫草素的測定

2.3.1 檢測波長的選擇

精密移取紫草素納米結構脂質載體供試液,空白納米結構脂質載體供試液以及紫草素對照品適量,用甲醇稀釋后,在200～800 nm范圍內掃描。結果發現紫草素納米結構脂質載體中紫草素與紫草素對照品在516 nm波長處均有最大吸收峰,而空白納米結構脂質載體在此波長處無吸收,對測定無干擾。因此選定516 nm作為測定藥物含量的波長。

2.3.2 標準曲線的繪制

精密稱取紫草素標準品適量,用甲醇配制成質量濃度分別為0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0mg/L溶液,以甲醇為空白對照,在516 nm處測定其吸收度A。得到標準曲線方程為A=0.016 8C+0.016 1(R=0.999 8),C紫草素質量濃度。表明紫草素對照品在0.5～40.0 mg/L濃度范圍內,與吸光度呈良好的線性關系。

2.3.3 精密度與回收率實驗

取上述紫草素對照品溶液0.5、10、40 mg/L(低、中、高)3個質量濃度,早、中、晚重復測定3次,連續測定3 d,計算得日內RSD分別為1.07%、0.59%、0.67%；日間RSD分別為1.44%、0.86%、1.28%,表明日內、日間精密度較好。

制備空白納米結構脂質載體,分別量取空白納米結構脂質載體 100 μL,分別加入0.5 g/L 的紫草素母液,用甲醇逐級稀釋定容至10 mL棕色容量瓶中配制成0.5、10、40 mg/L(低、中、高)3個質量濃度的溶液,早、中、晚重復測定3次,按標準曲線計算回收率。結果表明,低、中、高3個質量濃度的紫草素回收率分別為99.2%(RSD=0.73%)、100.13%(RSD=0.66%)、98.73%(RSD=1.17%),表明回收率良好,空白納米結構脂質載體即輔料對測定結果無干擾。

2.3.4 包封率的測定

精密吸取紫草素納米結構脂質載體供試液1.0 mL,上樣經處理的葡聚糖凝膠柱Sephadex G-50柱(長度20 cm,內徑1 cm),用磷酸鹽(pH7.4)緩沖液洗脫,流速1 mL/min,收集樣品,每管2.0 mL,將上述各管收集液分別置10 mL容量瓶,用甲醇定容；超聲2 min,搖勻；設置波長516 nm測定藥物含量,考察流出曲線,計算包封率。

2.4 采用正交試驗設計法優化處方

在預試驗的基礎上,選擇對紫草素納米結構脂質載體影響較大的3個因素,即固相脂質與液相脂質重量的比值(E)、藥物與總脂質重量的比值(F)、乳化劑的質量分數(G),采用正交試驗設計法,按照L9(33)正交表設計成3因素3水平的正交試驗,以粒徑和包封率為參考指標對處方進行進一步篩選,詳見表1。

表1 紫草素納米結構脂質載體的正交試驗設計表

2.5 體外釋放度考察

采用動態透析法,精密移取紫草素納米結構脂質載體2 mL于已活化好的透析袋中,兩端用透析夾加緊,置于裝有40 mL溶出介質(pH7.4)的具塞錐形瓶中；放入37 ℃空氣恒溫振蕩器中,100次/min振蕩,于1、2、4 、8 、12、24、48、72 h取樣,并更換新鮮透析介質。取出的樣品在波長516 nm處測定藥物含量。同時以游離藥物紫草素的釋放作對照。根據公式計算各時間點相對累積釋放率(相對累積釋放率=某個時間點取樣測定的總量/72 h的最終釋放量),繪制釋放曲線。

3 結果

3.1 正交試驗設計法優化處方結果

按L9(33)正交表設計成3因素3水平的正交試驗,以粒徑(PS)、包封率(EE)為參考指標對處方進一步篩選,試驗結果見表2。可得最優處方為A2B3C3,即固相脂質與液相脂質重量的比值為1∶1,藥物與總脂質重量的比值為1∶25,乳化劑的重量百分比為1.5%。

表2 紫草素納米結構脂質載體的正交試驗設計結果及分析

3.2 粒徑分布、Zeta電位、包封率及形態學觀察

取由優化處方制備的紫草素納米結構脂質載體樣品溶液,蒸餾水稀釋100倍后,用激光納米粒度分析儀測量粒徑分布和Zeta電位,粒徑結果為(209.7±3.4) nm,Zeta電位為(-34.57±1.53) mV,Zeta電位結果表明制備的紫草素納米結構脂質載體體系的穩定性良好。采用葡聚糖凝膠G50柱分離,紫外分光光度法測定紫草素納米結構脂質載體的包封率為(91.66±3.08)% 。

觀察紫草素納米結構脂質載體樣品溶液的外觀均一穩定,無沉淀,具有紫紅色乳光(圖1(a))。透射電鏡下觀察為圓形小球,分散均勻,形狀規整,大小在200 nm左右(圖1(b))。與激光納米粒度儀測定結果相吻合。

圖1 紫草素納米結構脂質載體的外觀形態與透射電鏡結果

3.3 體外釋放結果

紫草素納米結構脂質載體的體外累積釋放曲線見圖2(R為累積釋放率)。由圖可得,游離藥紫草素在12 h累計釋放量已達到(92.06±1.56)%,紫草素納米結構脂質載體在12 h內累計釋放僅達到(66.40±1.12)%,72 h后達到(89.75±0.91)%。進一步觀察釋放曲線,與游離藥紫草素相比,紫草素納米結構脂質載體表現出明顯的緩釋行為,呈現先突釋,后緩釋的效果。

圖2 紫草素納米結構脂質載體的體外累積釋放曲線

對紫草素納米結構脂質載體累積釋放率R與時間t按照零級、一級、Higuchi、Weibull和Korsmeyer-Peppas方程進行擬合,結果見表3。結果表明,以Weibull方程擬合的相關系數最大,說明該方程能較好地描述紫草素納米結構脂質載體的體外釋藥特征。

表3 紫草素納米結構脂質載體的釋放曲線擬合結果

4 討論

納米結構脂質載體采用混合脂質為載體,將常溫下為液態的脂質加入到固態脂質中,使晶體混亂度增加,承載藥物空間增大,是特殊骨架材料的納米粒,能夠保護藥物免受降解,提高穩定性,改善藥物的藥理學與藥代學性質,目前已成為國內外新劑型研究熱點[16]。本實驗采用高壓乳勻法制備,正交試驗設計法篩選出最優處方,得到的紫草素納米結構脂質載體外觀圓整,粒徑分布均勻,體系穩定,優化的制備條件重復性較好。

體外釋放實驗中紫草素納米結構脂質載體呈現先突釋、后緩釋的效果,分析原因可能由于藥物分子一部分吸附或嵌在納米結構脂質載體表面,另一部分鑲嵌在納米結構脂質載體的骨架中或被包裹在其內部。吸附在表面或表層的藥物快速釋放,構成釋放曲線初始階段的突釋結果,之后被包裹的藥物從納米結構脂質載體骨架中擴散出再釋放,構成釋放曲線后段的緩釋結果。說明納米結構脂質載體以先快后慢的方式釋放紫草素,推測在體內先釋放的藥物可迅速起效,后緩釋釋放的藥物可以持續作用,獲得更好的治療效果。后續實驗將對紫草素納米結構脂質載體的體內轉運吸收特性做更深入的研究,以期為高效低毒、穩定安全的藥物新劑型研究提供科學依據。