化妝品功效評價（XI）
——體外試驗技術(shù)在發(fā)用化妝品功效評價中的應(yīng)用

何文丹 ，劉 磊 ，楊舒顏 ，唐 穎

（1.北京工商大學(xué) 理學(xué)院 化妝品系，北京 100048；2.北京市植物資源研究開發(fā)重點實驗室，北京 100048）

發(fā)用化妝品包括育發(fā)、染發(fā)、燙發(fā)類的特殊用途化妝品和清潔、護發(fā)類的非特殊用途化妝品。它們的作用對象包括毛發(fā)及其賴以生長的皮膚區(qū)域（頭皮）。發(fā)用化妝品的品種繁多，功能和作用機理各異。例如洗發(fā)水用于清潔頭發(fā)和頭皮，護發(fā)素用于保護頭發(fā)纖維并提供理想的外觀和觸感，這些產(chǎn)品主要改變頭發(fā)表面的粗糙度、摩擦和粘附性能，而染發(fā)和燙發(fā)產(chǎn)品則主要通過改變頭發(fā)內(nèi)部的化學(xué)成分及相關(guān)物理性質(zhì)來實現(xiàn)其功能。近年來，我國發(fā)用化妝品行業(yè)發(fā)展迅速，市場競爭激烈，而消費者日趨理性，對產(chǎn)品功效越來越重視。如果化妝品功效宣稱缺乏充分的科學(xué)依據(jù)，勢必影響產(chǎn)品的市場推廣。因此，如何運用生物學(xué)、化學(xué)和物理學(xué)手段對發(fā)用化妝品的不同功效進行科學(xué)表征和評價，是發(fā)用化妝品研發(fā)的重要課題，也是化妝品行業(yè)十分感興趣的問題。

目前對化妝品的功效評價主要通過體內(nèi)試驗和體外試驗兩種技術(shù)途徑實現(xiàn)。體內(nèi)試驗以動物試驗和志愿者人體試驗為主，還包括了人體感官和主觀性評價。體外試驗主要通過離體培養(yǎng)的細胞、微生物和組織等體外生物學(xué)模型進行。此外，由于頭發(fā)的發(fā)干部分是由無生命的蛋白質(zhì)纖維構(gòu)成，發(fā)用化妝品的體外評價還可以采用以波譜學(xué)、理化分析為代表的材料學(xué)儀器分析。2013年歐盟全面禁止化妝品動物試驗禁令的提出，推動了體外試驗技術(shù)在化妝品評價領(lǐng)域的發(fā)展與進步。與此同時，相對于試驗周期長、成本高、主觀性強的傳統(tǒng)動物試驗和人體試驗，體外試驗在評價時還具有試驗周期短、經(jīng)濟簡便和易于開展深層次機理研究等優(yōu)點，因此越來越受到行業(yè)和消費者的重視。

根據(jù)作用部位的不同，可以將發(fā)用化妝品分為作用于頭發(fā)纖維和作用于頭皮兩類。對于作用部位在頭發(fā)纖維的大多數(shù)發(fā)用化妝品（包括清潔、修復(fù)、漂染、定型等），其功效評價主要針對頭發(fā)纖維的形貌、結(jié)構(gòu)、化學(xué)成分和機械性能等的改變；而對于作用部位在頭皮的發(fā)用化妝品（如去屑、育發(fā)），其功效評價主要通過體外生物學(xué)模型進行。

1 針對頭發(fā)纖維的體外評價

人的頭發(fā)纖維直徑為50～100 μm，由角質(zhì)層、毛皮質(zhì)和毛髓質(zhì)三部分組成。最外層的角質(zhì)層覆蓋著毛鱗片，構(gòu)成了毛發(fā)表面約5 μm厚的保護層。最內(nèi)側(cè)區(qū)域的毛髓質(zhì)厚度為5～10 μm，由中空細胞組成。位于毛發(fā)中間區(qū)域的毛皮層（約45～90 μm）是毛發(fā)主要的結(jié)構(gòu)支撐部分，由長圓柱形組裝的皮質(zhì)細胞和細胞膜復(fù)合物（CMC）組成。皮質(zhì)細胞由卷曲螺旋的α-角蛋白和角蛋白締合蛋白（KAP）橫向組裝成的微纖維和間質(zhì)材料構(gòu)成[1]。頭發(fā)纖維由無生命的死細胞構(gòu)成，因此，針對頭發(fā)纖維的體外評價主要運用多種材料學(xué)和生物物理學(xué)儀器分析手段開展，包括顯微成像分析、光譜、蛋白質(zhì)組質(zhì)譜、機械張力和摩擦力學(xué)等分析方法。

1.1 顯微成像分析

運用各種顯微成像技術(shù)可方便地對頭發(fā)纖維的微觀結(jié)構(gòu)進行觀察，并對包括化妝品、光照、機械損傷、干燥等對毛發(fā)的影響進行評估。

1.1.1 掃描電子顯微鏡

掃描電子顯微鏡（Scanning electron microscopy，SEM）是一種在真空下利用聚焦電子束掃描能夠使樣品表面產(chǎn)生放大和清晰圖像的成像技術(shù)[2]。利用SEM可以對頭發(fā)纖維的微觀結(jié)構(gòu)和形態(tài)學(xué)變化進行直接觀察，是對頭發(fā)進行顯微成像分析最常用的方法。例如頭發(fā)纖維表面毛鱗片的形態(tài)容易受到光照、風(fēng)化和梳理的影響，而發(fā)梢與發(fā)尾通常存在明顯的老化差異。2010年巴黎歐萊雅集團（中國區(qū)）用SEM對一名女性的4.3 m長發(fā)的發(fā)根、中間部分和發(fā)尾部分進行觀察，發(fā)現(xiàn)毛發(fā)根部的毛鱗片組織結(jié)構(gòu)完好，中間部分的毛鱗片翹起、邊緣變得粗糙，而發(fā)梢的毛鱗片已經(jīng)完全脫落，直接暴露了毛皮質(zhì)[3]。SEM還能觀察發(fā)用化妝品處理對頭發(fā)微觀結(jié)構(gòu)的影響，從而對其損傷或修復(fù)功能進行定性或半定量評價。韓國延世大學(xué)的Ahn等[4]曾報道了一項永久性染發(fā)劑對毛發(fā)損傷的SEM研究，發(fā)現(xiàn)未染色的毛發(fā)具有完整而致密的毛鱗片，毛發(fā)表面均勻有光澤，而染發(fā)的毛鱗片則變得破碎、剝離和脫落。2012年，西班牙學(xué)者Fernández等[5]通過SEM觀察發(fā)現(xiàn)使用朝鮮薊提取物制備成的護發(fā)劑對頭發(fā)表面毛鱗片在老化過程中的翹起有改善作用，因此認為該提取物具有護發(fā)功效。

1.1.2 透射電子顯微鏡

透射電子顯微鏡（Transmission electron microscopy，TEM）是將經(jīng)加速和聚焦的電子束投射到非常薄的樣品（一般需要切片）上，利用電子與樣品中的原子碰撞產(chǎn)生立體角散射而成像的一種顯微成像技術(shù)。該系統(tǒng)是由封裝在低壓抽空柱子中控制光束的電磁透鏡組成的發(fā)射電子源，當(dāng)電子束通過樣品時，由于衍射電子束的角度分布而形成可觀察的圖像。利用TEM可以觀察頭發(fā)纖維內(nèi)部橫截面的超微結(jié)構(gòu)。在上述Ahn等[4]的研究中，還同時應(yīng)用TEM觀察永久性染發(fā)劑染發(fā)引起毛發(fā)表層在橫截面上的變化，發(fā)現(xiàn)染發(fā)導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)損傷（表現(xiàn)為角質(zhì)層細胞的破碎和空洞化）在6～24 h內(nèi)最嚴重，需要8周才能恢復(fù)到未染發(fā)狀態(tài)，因此建議消費者補染發(fā)的間隔為8周時間[4]。類似的，2016年巴西的一項利用TEM分析毛發(fā)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的研究也觀察到了頭發(fā)在紫外線輻射和水洗過程中的微觀結(jié)構(gòu)損害，認為光照和過度清洗都會使毛發(fā)變得脆弱[6]。而韓國的一項TEM研究表明，在護發(fā)產(chǎn)品中添加原花青素低聚物可以減緩漂染處理中毛發(fā)皮質(zhì)中黑素小體和蛋白質(zhì)的降解[7]。

1.1.3 原子力顯微鏡

原子力顯微鏡（Atomic force microscopy，AFM）是通過探針與被測樣品之間的微弱的相互作用力即原子力來獲得物質(zhì)表面形貌的信息，從而獲得納米尺度顯微成像的技術(shù)。AFM由于具有超高圖像分辨率、測試和樣品制備時的簡易性（無需SEM和TEM時的噴金制樣和高真空條件），在局部的三維拓撲成像時具有獨特的優(yōu)點。在過去的20年里，AFM被廣泛地應(yīng)用于研究頭發(fā)角質(zhì)層的各種微納結(jié)構(gòu)（如A層、外表皮、內(nèi)皮細胞和細胞膜復(fù)合物），并用這些數(shù)據(jù)來比較研究環(huán)境因素和化妝品處理對頭發(fā)粗糙度和摩擦力學(xué)性質(zhì)的影響，從而對產(chǎn)品的護發(fā)效果進行評價。如Chen等[8]利用AFM的不同模式對頭發(fā)表面上的護發(fā)素的分布、厚度與頭發(fā)摩擦力學(xué)性質(zhì)之間的關(guān)聯(lián)性進行研究。AFM還可以用來表征毛發(fā)纖維的各種物理特性，如摩擦力、附著力、磨損、彈性剛度和黏彈性等納米力學(xué)性能。2013年，英國樸茨茅斯大學(xué)使用AFM圖像確定了頭發(fā)表面亞結(jié)構(gòu)的微尺度摩擦系數(shù)、尖端-表面粘附力和相應(yīng)的粘附能量值[9]。另一項研究[10]通過AFM成像表征了頭發(fā)纖維的納米楊氏模量，并發(fā)現(xiàn)漂白后毛發(fā)表面的模量降低，表現(xiàn)為纖維彈性下降。

1.1.4 光學(xué)相干斷層掃描

對頭發(fā)纖維截面的高分辨率圖像分析還可以通過光學(xué)相干斷層掃描（Optical coherence tomography，OCT）進行。OCT利用低長度相干干涉測量的原理，通過設(shè)備的直接相干反射光子獲得具有高分辨率層析成像的生物結(jié)構(gòu)圖像[11]。2014年，巴黎歐萊雅集團（美國區(qū)）使用X射線斷層顯微鏡研究了非裔美國女性毛發(fā)斷裂情況，發(fā)現(xiàn)當(dāng)頭發(fā)纖維拉伸超過30%后，毛發(fā)的橫截面積（尤其是斷裂發(fā)生的部位）明顯減小[12]。此外，由于OCT可以分析毛發(fā)在相同部位由外界因素引起的結(jié)構(gòu)和形態(tài)學(xué)變化，具有對同一部位的變化進行精確比較、減小測量誤差的優(yōu)點。2016年，巴西圣保羅大學(xué)報道了使用OCT觀察氧化型染發(fā)劑染發(fā)引起同一部位毛發(fā)的超微結(jié)構(gòu)變化，研究發(fā)現(xiàn)染發(fā)后毛發(fā)的散射系數(shù)和折射率增加，而毛髓質(zhì)和毛皮質(zhì)的OCT圖像清晰度降低，從而判斷髓質(zhì)和皮質(zhì)結(jié)構(gòu)受損[13]。

1.2 光譜分析

光譜分析是根據(jù)物質(zhì)的光學(xué)特性，鑒別物質(zhì)及確定其化學(xué)成分的技術(shù)。目前在發(fā)用化妝品功效評價中最常用的是紫外可見光譜、熒光光譜、紅外光譜和拉曼光譜。

1.2.1 紫外可見光譜

紫外可見光譜（UV-Visible spectroscopy）包括紫外可見光區(qū)域（320～780 nm）的漫反射光譜（Diffuse reflectance spectroscopy，DRS）和吸收光譜（Absorption spectroscopy，AS）。漫反射光譜反映了物質(zhì)在紫外可見光波段的反射率，常用于判斷樣品的色彩和明暗度。通過將放射率數(shù)值轉(zhuǎn)換為CIELab色彩空間，漫反射光譜可用于定量評價染護發(fā)產(chǎn)品處理后頭發(fā)纖維的光澤和顏色變化。2016年，北京工商大學(xué)唐穎[14]通過漫反射光譜研究了包括自然白/黑發(fā)、灰發(fā)和漂染發(fā)等不同類型的中國人頭發(fā)在UVA光老化中的顏色變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同類型的頭發(fā)對紫外輻射的敏感程度和光變色反應(yīng)具有明顯差異，漂染過的頭發(fā)表現(xiàn)出光變暗，而自然白發(fā)表現(xiàn)出光黃化。而Dario等[15]的一項研究發(fā)現(xiàn)，將石榴提取物復(fù)配成護發(fā)素可以有效減少染發(fā)在光老化中的顏色變化。吸收光譜反映了物質(zhì)生色團在可見光波長范圍內(nèi)的吸收特征，常用于染料或吸光物質(zhì)的定量分析。2014年，Pires-Oliveira等[16]通過分析毛發(fā)提取物溶液的吸收光譜，比較研究了4種表面活性劑引起的毛發(fā)損傷，發(fā)現(xiàn)吸收峰面積與毛發(fā)降解得到的黑色素顆粒和蛋白質(zhì)成分成正比，建立了對毛發(fā)損傷進行表征的分光光度法。

1.2.2 熒光光譜

熒光光譜（Fluorescence spectroscopy）是指利用某些熒光物質(zhì)在紫外光照射下產(chǎn)生熒光的特性進行物質(zhì)的定性或定量分析的方法。頭發(fā)角蛋白中的氨基酸如色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸都是熒光基團，因此可以通過熒光光譜評估頭發(fā)中蛋白質(zhì)成分的降解以及護發(fā)產(chǎn)品中功效成分對毛發(fā)的保護作用。2012年，Estibalitz等[17]發(fā)現(xiàn)通過對頭發(fā)中色氨酸熒光強度的監(jiān)測可定量毛發(fā)的光損傷；并在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)使用大米提取物制備成護發(fā)素對頭發(fā)具有光防護作用[5]。除了二維發(fā)射光譜對色氨酸進行定量檢測外，還可以利用三維熒光光譜得到指紋圖譜對頭發(fā)纖維中存在的多種氨基酸及其氧化產(chǎn)物同時進行分析，來鑒別不同化妝品處理過的頭發(fā)類型及其光老化規(guī)律[14]。

1.2.3 傅里葉變換紅外光譜

傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T IR）由化合物的分子振動能級在吸收紅外光照后發(fā)生躍遷而產(chǎn)生，包含了化合物的官能團、結(jié)晶態(tài)等結(jié)構(gòu)信息。將FT IR與ATR衰減全反射相連，可直接對頭發(fā)纖維進行測量，利用紅外光譜的指紋特征性評估不同化妝品處理（如保濕、漂白和染色等）對頭發(fā)角蛋白分子結(jié)構(gòu)和形態(tài)的影響[18]。2016年，北京工商大學(xué)唐穎等[14]通過FT IR指紋圖譜對不同漂染處理后的頭發(fā)樣本進行分析，發(fā)現(xiàn)UVA和過氧化氫可以使毛發(fā)中胱氨酸的二硫鍵斷裂，產(chǎn)生半胱氨酸，而后者易被氧化產(chǎn)生大量磺基丙氨酸。由于頭發(fā)表面胱氨酸含量相對恒定（約11%～18%），因此磺基丙氨酸可用來監(jiān)測高硫蛋白的氧化程度。

1.2.4 拉曼光譜

拉曼光譜（Raman spectroscopy，RS）是利用化合物受光照射后發(fā)生振動產(chǎn)生的非彈性散射光譜（“拉曼效應(yīng)”），對物質(zhì)的組成和分子結(jié)構(gòu)進行定性和定量分析的技術(shù)。對頭發(fā)纖維拉曼光譜的測量，可以反映蛋白質(zhì)主鏈的骨架振動、氨基酸的側(cè)鏈構(gòu)象與存在形式以及外部環(huán)境變化引起的微小改變（S-S的構(gòu)象和蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)等）[19]。2006年—2010年，日本中央研究實驗室通過一系列基于拉曼光譜的機制研究，探討了老化和漂染等對毛發(fā)在黑色素含量、蛋白質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)和抗拉強度等方面的影響[20，21]。他們通過直接分析不同年齡、不同處理（漂白發(fā)或黑色頭發(fā)）在不同深度橫截面的拉曼光譜，發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長，毛發(fā)皮質(zhì)區(qū)黑色素顆粒含量減少[22]；而漂白處理后毛發(fā)中的二硫鍵從角質(zhì)層到皮質(zhì)層的含量降低，同時半胱氨酸含量增加，此外，漂粉中的氧化劑還促進了頭發(fā)皮質(zhì)中黑色素顆粒的分解，使黑發(fā)在漂白過程中二硫化物基團的裂解水平更高[23]。

1.3 色譜

色譜（Chromatography）分析是按物質(zhì)在固定相與流動相間分配系數(shù)的差別而進行分離、分析的技術(shù)。在評價化妝品對毛發(fā)的損傷程度時，常利用色氨酸對蛋白質(zhì)成分的損失進行定量評估，而用熒光分光光度法定量色氨酸容易受到檢測系統(tǒng)中其他熒光物質(zhì)的影響。2017年，Dario等[24]開發(fā)了一種使用具有熒光和UV檢測的高效液相色譜法（HPLC），在毛發(fā)樣品堿水解后對色氨酸和光氧化物犬尿氨酸進行定量檢測的方法。結(jié)果表明，漂白和染色過程會導(dǎo)致蛋白質(zhì)/氨基酸的損失，但色氨酸不會在毛發(fā)的光老化中大量降解。Khumalo等[25]將頭發(fā)經(jīng)過鹽酸水解后結(jié)合氨基酸分析儀進行色譜分析，發(fā)現(xiàn)受損的毛發(fā)中的精氨酸、瓜氨酸和胱氨酸含量降低，谷氨酰胺水平增加。此外，色譜還常與質(zhì)譜聯(lián)用，廣泛用于化妝品中的功效成分或禁限用成分的定量檢測。

1.4 質(zhì)譜

質(zhì)譜（Mass spectrometry，MS）是將被測物質(zhì)離子化，按離子的質(zhì)荷比分離，通過測量各種離子譜峰的強度而實現(xiàn)分析目的的一種分析方法。毛發(fā)中的角蛋白和角蛋白締合蛋白（KAP）賦予了毛發(fā)重要的結(jié)構(gòu)和機械性能?；诘鞍踪|(zhì)組學(xué)的質(zhì)譜技術(shù)可以通過鑒定毛發(fā)中存在的所有角蛋白和主要KAP中氨基酸基團的修飾變化，從而對不同化妝品處理或環(huán)境因素對毛發(fā)纖維蛋白質(zhì)的影響進行表征。2013年，新西蘭農(nóng)業(yè)研究所Dyer等[26]使用LC-MS/MS鑒定堿處理、漂白處理前后毛發(fā)樣品中蛋白質(zhì)含量變化，結(jié)果表明堿處理會輕微增加毛發(fā)的氧化損傷程度，而漂白處理對毛發(fā)角蛋白（主要是半胱氨酸）造成明顯的氧化損害。2016年，北京工商大學(xué)和Dyer合作采用此技術(shù)分析中國人的常染發(fā)人群的頭發(fā)樣本，發(fā)現(xiàn)染發(fā)的蛋白質(zhì)氧化水平比未染發(fā)增加了近1.6倍，因此常染色的毛發(fā)更容易受到日光損傷[27]。

1.5 熱分析

熱分析是在程序控溫下，測量物質(zhì)的物理性質(zhì)隨溫度變化的一類技術(shù)，包括熱重分析（TG）、衍生熱重分析（DTG）、差熱分析（DTA）和差示掃描量熱法（DSC）。其中，DSC常用于角蛋白變性溫度以及角蛋白變性焓的測定[28，29]。近年來，DSC越來越多地用于護發(fā)產(chǎn)品的功效評價。2011年，Rigoletto等[30]通過DSC評估毛發(fā)角蛋白降解和評價化妝品對損傷毛發(fā)的修復(fù)效果。結(jié)果表明，隨著熱處理溫度從205 ℃上升到232 ℃，角蛋白的變性溫度和變性晗均顯著下降，蛋白質(zhì)降解更加嚴重，而使用聚合物（月桂基甲基丙烯酸酯共聚物、聚季銨鹽-55等）對毛發(fā)進行處理后，可有效降低角蛋白的熱降解和減輕毛小皮損傷。2016年，花王研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)干發(fā)中的α-角蛋白發(fā)生變性和降解，濕發(fā)的DSC變性溫度反而降低，提出DSC還應(yīng)與XRD、拉伸實驗等方法聯(lián)用以更好地理解化妝品對毛發(fā)的實際作用效果[31]。

1.6 機械性能分析

毛皮質(zhì)中的α-角蛋白和二硫鍵決定了毛發(fā)纖維的機械性能（拉伸性和扭轉(zhuǎn)性）。與此同時，毛發(fā)的機械性能還受到各種環(huán)境因素的影響：相對濕度或溫度的升高會導(dǎo)致楊氏模量的降低和延展性的增加，而扭曲會對毛發(fā)纖維造成傷害，導(dǎo)致斷裂應(yīng)力、斷裂應(yīng)變和楊氏模量的降低[32]。對毛發(fā)的拉伸等機械性能分析可以利用美國英斯特朗INSTRON系列萬能材料測試儀、英國戴亞斯特隆公司（Dia-Stron） MTT拉伸試驗機等儀器進行測定，測試參數(shù)包括拉伸強度、斷裂應(yīng)力、斷裂應(yīng)變曲線、斷裂伸長率等[30-33]。Davis等[33]通過拉伸性測試和扭轉(zhuǎn)測試發(fā)現(xiàn)一個包含咖啡因、煙酰胺和泛醇的配方具有增強毛發(fā)拉伸力和柔韌性的功效。毛發(fā)纖維在外力作用下的拉伸性和扭轉(zhuǎn)性還與其柔韌性相關(guān)，除了護發(fā)產(chǎn)品，還可用于評價毛發(fā)造型類產(chǎn)品。例如，上海工程技術(shù)大學(xué)Yan等[34]通過測定一種聚氨酯聚合物涂覆后對毛發(fā)機械性能的影響，評價這種發(fā)用定型劑的形狀記憶效應(yīng)和耐水洗性能。

1.7 梳理性能表征

毛發(fā)纖維的摩擦系數(shù)和彈性特性是毛發(fā)梳理性能中的重要物理參數(shù)。與毛發(fā)的摩擦學(xué)特性緊密相關(guān)的是其毛干表面的脂質(zhì)（18-甲基二十烷酸）和角蛋白構(gòu)成的毛鱗片。當(dāng)毛發(fā)光老化或損傷后，脂質(zhì)流失、毛鱗片變得翹起、剝落，就會導(dǎo)致毛發(fā)表面變得粗糙，摩擦系數(shù)上升，同時手觸摸時的柔軟度下降，毛發(fā)變得難以梳理或易打結(jié)。因此，表征毛發(fā)表面的摩擦學(xué)性質(zhì)對于量化梳理性能和評估洗護發(fā)產(chǎn)品的功效十分重要。Chevalier[35]通過尼龍螺紋實驗得到了計算單根毛發(fā)的自摩擦系數(shù)方程，并用此測得濕發(fā)的靜摩擦系數(shù)明顯高于干發(fā)，還發(fā)現(xiàn)堿處理會導(dǎo)致毛發(fā)摩擦系數(shù)的不可逆增大。自20世紀50年代Roeder開發(fā)首個毛發(fā)靜摩擦力的測試方法以來，目前已有多種方法和技術(shù)可對毛發(fā)-毛發(fā)界面的摩擦力進行定量測定，包括Dussaud的“斜面法”和Luengo的“AFM懸臂法”等[35，36]，并出現(xiàn)了專門針對毛發(fā)的測試儀器，方便對發(fā)用化妝品梳理性能進行評價，如Dia-Stron MTT系列測試儀和亞什蘭公司的Aqualon SLT組件等。圣保羅大學(xué)Da等[37]使用Dia-Stron MTT175測試儀分析不同護發(fā)劑對染發(fā)后毛發(fā)的保護作用，結(jié)果表明含烷三醇和泛醇的配方可有效降低毛發(fā)的梳理阻力。

2 針對頭皮的體外評價

毛發(fā)的生長離不開頭皮上的毛囊組織。毛囊是頭皮的表皮向真皮處下陷而形成的重要的附屬結(jié)構(gòu)，分為表皮層與真皮層兩部分。毛囊表皮層包括內(nèi)根鞘（IRS）和外根鞘（ORS），內(nèi)根鞘在皮脂腺開口處與內(nèi)陷的表皮水平相連，起決定毛發(fā)形狀的作用。外根鞘形成突起的毛囊隆突區(qū)，含有多種干細胞，這些干細胞與附近的上皮細胞、內(nèi)外根鞘、基底膜或者纖維細胞相互作用調(diào)控毛發(fā)的生長。對于作用部位在頭皮的育發(fā)、去屑類化妝品，主要通過人工培養(yǎng)的細胞、微生物模型和離體的毛囊組織來進行相關(guān)功效的體外評價。

2.1 細胞模型

育發(fā)類化妝品產(chǎn)品在功效評價時常采用真皮乳頭細胞、角質(zhì)細胞和毛囊上皮細胞，通過受試物對細胞增殖的促進作用、細胞因子（如VEGF）和相關(guān)基因表達的變化等來衡量其功效成分對毛發(fā)增長的促進效果。韓國學(xué)者Rho等[38]報道了木香烴內(nèi)酯（一種木香根中的倍半萜類提取物）可以刺激永生化的人頭皮毛囊真皮乳頭細胞（hHFDPC）的增殖，并在進一步的動物實驗中得到了驗證，表明該成分具有顯著的育發(fā)效果。永生化人角質(zhì)細胞（HaCaT）和真皮乳頭細胞（DP）被廣泛地應(yīng)用于育發(fā)和防脫發(fā)功效成分的篩選，多種植物提取物及化學(xué)合成物質(zhì)在體外細胞和在進一步的動物實驗中得到了一致的結(jié)果[39-41]。此外，由于白發(fā)的產(chǎn)生被認為與高氧化壓力對黑色素的破壞有關(guān)，歐萊雅報道了采用過氧化氫損傷的人原代黑色素細胞模型用在烏發(fā)功效的評價上，如何首烏提取物被發(fā)現(xiàn)可有效抑制細胞內(nèi)ROS水平升高和細胞凋亡，抑制氧化應(yīng)激下黑色素的減少，從而起到烏發(fā)固色的作用[42]。

2.2 微生物模型

馬拉色菌（Malassezia）與頭皮屑的形成密切相關(guān)，頭皮上真菌主要為馬拉色菌，其中限制性馬拉色菌（M.restricta）和球形馬拉色菌（M.globaso）為優(yōu)勢種屬[43]。因此，馬拉色菌抑菌試驗被廣泛應(yīng)用于添加了抗菌成分的去屑洗發(fā)水的功效評價。德國拜爾斯道夫公司[44]報道了通過對馬拉色菌抑菌圈大小的測定，結(jié)合人體實驗，比較含有不同抗菌原料（如吡羅克酮乙醇胺、氯胺酮和吡啶硫酮鋅）洗發(fā)水的去屑功效。除了比較不同配方產(chǎn)品，馬拉色菌實驗還被廣泛應(yīng)用于抑菌去屑功效原料的篩選。多篇文獻[45，46]報道了通過馬拉色菌最小抑菌濃度（MIC）的測定篩選出了具有良好去屑抑菌性能的植物提取物（如茶樹油、蘆筍根提取物等）。這些植物成分可以作為化學(xué)抗菌劑的天然替代品用在去屑化妝品中。

2.3 組織模型

組織模型包含從人或者動物分離培養(yǎng)的毛囊體外培養(yǎng)系統(tǒng)和商業(yè)化的3D皮膚模型。與細胞系相比，這類組織模型在三維結(jié)構(gòu)和生理功能等方面更接近真實人體，一般認為在功效評價時具有更高的可靠性。因此，近年來，體外毛囊培養(yǎng)系統(tǒng)在國內(nèi)外被廣泛應(yīng)用于生發(fā)、育發(fā)藥品及其育發(fā)類化妝品的研究與開發(fā)。Park等[47]報道了使用離體培養(yǎng)的人毛囊組織研究雙-油酰氨基異丙醇（BOI）對毛發(fā)生長的影響，發(fā)現(xiàn)BOI處理能促進毛囊中的毛發(fā)生長并能將毛發(fā)的生長期由生長終期誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為生長初期。此外，組織模型還可以與外源微生物共培養(yǎng)，進行包括抗菌、去屑功效的評價。2013年，聯(lián)合利華報道了將馬拉色菌接種于VitroSkinTM皮膚模型上，發(fā)現(xiàn)復(fù)配有抗菌成分（吡啶硫酮鋅和甘寶素）的洗發(fā)水具有良好的去屑功效[44]。

3 發(fā)用化妝品體外功效評價方法匯總

與傳統(tǒng)的動物和人體試驗方法相比，以生物物理學(xué)儀器分析和離體生物學(xué)模型為代表的體外評價方法，具有經(jīng)濟、簡便、快捷的優(yōu)點，對于發(fā)用化妝品功效性原料的篩選、作用機理研究和配方的優(yōu)化設(shè)計均具有重要的現(xiàn)實意義。表1總結(jié)了目前常用的發(fā)用化妝品的體外功效評價技術(shù)。其中，針對頭發(fā)纖維部位的評價主要采用無損或微損的儀器分析，評價化妝品處理后頭發(fā)纖維在顏色、亮度、微觀結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)損失和力學(xué)特性等方面的變化。對于作用部位在頭皮的發(fā)用化妝品，其功效評價主要采用體外生物學(xué)模型。多種皮膚細胞、毛囊組織和微生物模型在育發(fā)、去屑類產(chǎn)品的功效評價中得到了廣泛的應(yīng)用。

表1 常用的發(fā)用化妝品功效評價的體外試驗方法Tab.1 In vitro techniques commonly used for the efficacy evaluation of hair cosmetics

4 結(jié)語

發(fā)用化妝品功效復(fù)雜、種類繁多，單一的體外試驗方法很難對產(chǎn)品進行全面評價?；瘖y品評價人員需要在掌握產(chǎn)品功效成分和作用機制的基礎(chǔ)上，綜合運用多種體外方法，將不同靶部位、不同層面的試驗技術(shù)手段有機結(jié)合起來，才能實現(xiàn)對一款發(fā)用化妝品的多角度、系統(tǒng)性功效評價。與此同時，如何在已有體外方法的基礎(chǔ)上，開發(fā)出適合臨床的原位快速檢測毛發(fā)理化性質(zhì)及成分變化的試驗技術(shù)也是未來發(fā)用功效評價發(fā)展的重要方向。