皮膚中神經酰胺的研究及應用現狀

王賀聰，何聰芬

（北京工商大學 理學院 北京市植物資源研究開發重點實驗室，北京 100048）

神經酰胺（Ceramides, Cers）存在于所有的真核細胞中，對細胞分化、增殖、凋亡、衰老等生命活動具有重要調節作用。神經酰胺作為皮膚角質層細胞間脂質的主要成分，不僅在鞘磷脂途徑中作為第二信使分子，還對表皮角質層形成過程發揮重要作用，具有維持皮膚屏障、保濕、抗衰老、美白和疾病治療等作用。

圖1 鞘脂類的結構式Fig.1 Structures of sphingolipids

1 神經酰胺概述

鞘脂類物質有3種，包括神經酰胺、鞘磷脂和鞘糖脂，結構式見圖1。當R為氫時，該物質為神經酰胺；當R為磷酸膽堿或磷酸乙醇胺時，該物質為鞘磷脂（Sphingomyelin, SM）；當R為葡萄糖或半乳糖等糖類時，該物質為鞘糖脂（Glycosphingolipid, GL）。神經酰胺結構中有兩條疏水鏈：一條長鏈氨基醇（long chain base, LCB），又稱鞘氨醇，一條脂肪酸鏈（fatty acid, FA），LCB中的氨基和FA中的羧基通過酰胺鍵連接而成，LCB鏈長一般為C18[1]，表皮中組成神經酰胺的FA鏈長一般為C24～C36。人角質層中非?；?神經酰胺的脂肪酸部分的鏈長主要為C24～C30，?；?神經酰胺的鏈長為C30～C36，且含有奇數碳原子數脂肪酸的神經酰胺水平在角質層中較高（約占神經酰胺總量的30%）[2]。神經酰胺LCB碳鏈中的雙鍵位置、羥基數目不同。FA的碳鏈長度不同，所以神經酰胺有不同種類，是結構相似的一類物質。

神經酰胺中的LCB分為神經鞘氨醇（Sphingosine,S）、二氫鞘氨醇（dihydrosphingosine, DS）、植物鞘氨醇（phytosphingosine, P）和6-OH鞘氨醇（6-hydroxy sphingosine, H），結構式見圖2。FA分為非羥基脂肪酸（Nonhydroxyl fatty acid, N）、α-OH脂肪酸（α-hydroxyl fatty acid, A）和ω-OH脂肪酸（ω-hydroxyl fatty acid, EO），結構式見圖3。根據LCB和FA的兩兩不同結合，可將皮膚角質層中神經酰胺分為12個亞類[3]，分別為NP（22.1%）、NH（14.5%）、AH（10.8%）、NDS（9.8%）、AS（9.6%）、AP（8.8%）、NS（7.4%）、EOS（6.5%）、EOH（4.3%）、ADS（1.6%）、EOP（1.1%）和EODs（0.4%），其中酰基神經酰胺（EOS、EOH、EOP、EODS）占角質層神經酰胺的12%[4]。若考慮到鏈長差異則神經酰胺目前發現有342種[5]，并且隨著分析技術的提高，通過高分辨率質譜技術目前已檢測出1 000多種神經酰胺[4]。

圖2 4種長鏈氨基醇的結構式Fig.2 Structures of 4 kinds of LCB

圖3 3種脂肪酸的結構式Fig.3 Structures of 3 kinds of fatty acids

2 體內神經酰胺的主要代謝途徑

2.1 神經酰胺合成途徑

神經酰胺是鞘磷脂代謝的中心環節，在體內內質網通過從頭合成途徑和鞘磷脂循環途徑合成神經酰胺，在表皮層通過板層小體分泌至角質層構成細胞間脂質成分。

2.1.1 從頭合成途徑

細胞膜上絲氨酸與軟脂酰輔酶A在絲氨酸棕櫚酰轉移酶的作用下形成3-羰基鞘氨醇，又在羰基還原酶的作用下形成二氫鞘氨醇，再經去飽和作用形成二氫神經酰胺，最終脫氫后形成神經酰胺。從頭合成途徑在細胞內質網進行，是體內基礎水平神經酰胺的生成途徑，所需時間較長，見圖4。

圖4 神經酰胺從頭合成途徑Fig.4 De novo synthesis pathway of ceramide

2.1.2 鞘磷脂循環途徑

鞘磷脂合成酶是鞘磷脂從頭合成途徑的關鍵酶，以磷脂酰膽堿和神經酰胺為底物合成鞘磷脂和二脂酰甘油（diacylglycerol, DAG），鞘磷脂在鞘磷脂酶的作用下水解為神經酰胺，神經酰胺又可以被鞘磷脂重新利用，由此形成“鞘磷脂循環”，又稱為補救合成途徑。鞘磷脂循環發生在細胞膜，可在短時間內迅速生成神經酰胺，是一條快速產生神經酰胺的途徑，見圖5。

圖5 鞘磷脂循環途徑Fig.5 Cycle pathway of sphingomyelin

2.1.3 神經酰胺在表皮層的形成途徑

人體皮膚中含有大量的神經酰胺，通過免疫組織化學反應發現基底細胞層和真皮層的神經酰胺主要分布于細胞核膜、線粒體內外膜、高爾基體、內質網和胞漿膜。在表皮上層，神經酰胺主要分布于板層小體、轉運高爾基體、角化細胞的包膜和角質層細胞間隙[6]。

神經酰胺在表皮主要是通過板層小體釋放入角質層細胞間，板層小體在角質形成細胞中，是一種雙分子膜分泌細胞器，其中含有葡萄糖基神經酰胺、膽固醇和一些酶類物質，伴隨角質形成細胞分化與細胞膜融合并胞吐形成神經酰胺、膽固醇和游離脂肪酸等脂質，對細胞間脂質的分泌有重要作用[7]，具體途徑見圖6。

圖6 表皮板層小體脂質的合成和分泌過程[7]Fig.6 Synthesis and secretion of lamellar body in epidermis[7]

在細胞間質，葡萄糖基神經酰胺和鞘磷脂分別在板層小體被β-葡糖腦苷脂酶和酸性鞘磷脂酶轉變為神經酰胺[8-10]。

2.2 神經酰胺合成相關酶

2.2.1 鞘磷脂合成酶（sphingomyelin synathase, SMS）

SMS是鞘磷脂合成的一種關鍵酶。大多數哺乳動物細胞含有存在于高爾基體內的SMS1和主要在細胞膜上的SMS2兩種亞型[11]。SMS1和SMS2可將磷脂酰膽堿的磷酸膽堿基團轉移到神經酰胺生成鞘磷脂和二脂酰甘油，反應的方向性主要決定于膜上神經酰胺和二脂酰甘油以及磷酸膽堿受體的相對濃度[12]。

神經酰胺在內質網產生后，被運送到高爾基體，大部分神經酰胺被位于高爾基體的SMS1轉化為鞘磷脂[13]。神經酰胺的分解產物二脂酰甘油或蛋白激酶C活化劑佛波酯能抑制神經酰胺介導的細胞調亡。

2.2.2 神經酰胺合成酶

哺乳動物有6種神經酰胺合成酶，每種酶對不同鏈長的酰基輔酶表現出特有的底物特異性[14]。除CER3合成酶和CER4合成酶存在于表皮及皮脂腺外，其他4種酶均在小腸及肝腎中。其中CER3合成酶主要存在于表皮層，底物?；o酶A大于等于十八碳，主要參與皮膚屏障的形成和精子的發生[15，16]。已有研究[17]表明CER3合成酶的缺乏會導致皮膚屏障缺陷引起魚鱗病，皮膚呈干燥、增厚和鱗片狀，還會導致新生兒致死性魚鱗病。CER4合成酶存在于表皮及皮脂腺中，通常以C18、C22輔酶A為底物[18]。CER4合成酶基因敲除小鼠會出現毛囊阻塞導致毛發減少，并伴隨C18和C20神經酰胺水平下降[19]。

2.3 神經酰胺分解相關酶

2.3.1 鞘磷脂酶

鞘磷脂酶是鞘脂類代謝中研究較為廣泛的酶，其作用是水解鞘磷脂的磷酸二酯鍵，生成神經酰胺和磷脂酰膽堿，是神經酰胺合成過程的關鍵酶。

中性鞘磷脂酶家族有3個成員分布于哺乳動物體內：主要定位于核基質、內質網等細胞器的中性鞘磷脂酶-1；廣泛存在于細胞質膜的胞漿面，與阿爾茨海默病的發展、骨骼生長有關中性鞘磷脂酶-2[20]；主要分布于心肌、條紋肌細胞內質網和高爾基復合體中的中性鞘磷脂酶-3[21]。酸性神經鞘磷脂酶作為神經鞘磷脂酶最重要的一個亞型，占神經鞘磷脂酶總活性的90%，在輻射誘導細胞凋亡、調節腫瘤細胞生長等方面均可發揮重要作用。酸性神經鞘磷脂酶在一定的外源刺激下能快速活化并釋放到細胞表面，水解細胞膜上的鞘磷脂，導致神經酰胺水平迅速上升，激活鞘磷脂循環途徑。以上兩種神經鞘磷脂酶均是通過水解神經鞘磷脂，調控胞內第二信使神經酰胺水平，參與細胞的應激、生長、分化和凋亡過程的調控。

2.3.2 神經酰胺酶

神經酰胺酶是清除神經酰胺的關鍵酶，神經酰胺可被神經酰胺酶分解成LCB，LCB又可在鞘氨醇激酶的作用下生成1-磷酸鞘氨醇，將細胞凋亡信號轉化為細胞增殖信號。迄今為止，已鑒定出5種由5種不同基因編碼的人神經酰胺酶：酸性神經酰胺酶（AC）、中性神經酰胺酶（NC）、堿性神經酰胺酶1 （Acer 1）、堿性神經酰胺酶2 （Acer 2）和堿性神經酰胺酶3 （Acer 3）。其中AC定位于溶酶體，具有調節細胞活力的作用；NC定位于質膜，主要表達于小腸和結腸，可參與消化過程，與結腸癌的發生有關[22]；Acer分布于細胞內質網及高爾基體，3種類型Acer的活性均可被鈣離子增強，被鋅離子和神經鞘氨醇抑制[23]。表皮角質形成細胞中Acer 1的高表達可使鞘氨醇和1-磷酸鞘氨醇水平上升，長鏈神經酰胺水平下降，促進Ca2+誘導的表皮角質形成細胞的生長抑制和分化作用[24]。Acer 2可促進細胞LCB和1-磷酸鞘氨醇的產生，但Acer 2過表達導致的LCB過量生成和積累使得細胞高爾基體破裂而誘發細胞生長抑制[25]。Acer 3參與運動協調相關的浦肯野細胞變性，還可通過調控神經鞘脂代謝影響與衰老有關的神經退行性疾病，如小腦的共濟失調等[26]。

3 神經酰胺的制備、分離及檢測方法

3.1 神經酰胺的制備方法

獲取神經酰胺的方式主要有3種：天然提取法、化學合成法和微生物發酵法。

天然提取的神經酰胺來源于動物和植物。動物中來源于有致病風險的動物腦部，所以不可應用于化妝品中[27]。而植物中魔芋提取的神經酰胺含量為其他植物的十幾倍[28]。但植物提取方法受植物生長周期和季節的限制，產量較低。

化學合成的主要是擬神經酰胺，其結構與神經酰胺相似，功能相似，可應用于化妝品中，目前已有多種擬神經酰胺成功合成，愛茉莉太平洋公司目前已生產出一種新型擬神經酰胺，提高了其溶解度和穩定性，其技術路線是將三羥甲基氨基甲烷溶于二甲基甲醛（DMF），再溶于三乙胺（Et3N），30 min后加入棕櫚酰氯經過一系列反應再引入脂肪酸，反應式見圖7[29]。

圖7 新型擬神經酰胺合成途徑Fig.7 Synthesis pathway of a new pseudo ceramide

微生物發酵法是近年來的常用制備神經酰胺的方法，即應用雪氏畢赤酵母（Pichiaciferrii）或釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在一定環境下發酵得到四乙酰植物鞘氨醇（TAPS）[30，31]，其結構式見下，再對其去乙酰化得到植物鞘氨醇，加入脂肪酸合成神經酰胺等物質[32]。生物發酵法外界干擾因素較少，可大量生產且降低神經酰胺的價格，更利于其在產品中的廣泛應用。

3.2 神經酰胺的分離方法

目前神經酰胺的分離方法主要包括薄層色譜法、高效液相色譜法和氣相色譜法。

角質層神經酰胺的分離方法主要是薄層色譜法和高效液相色譜法。薄層色譜法是較為傳統的分離方法，通過流動相將樣品在固定相上分離出來，含量較低的樣品用此方法有一定的限制。高效液相色譜法是以液體為流動相，利用高壓輸液原理將其泵入裝有固定相的色譜柱中，在柱內實現各成分的分離，再通過檢測系統進行化合物檢測。正相色譜是常用的神經酰胺的分離方法，但有研究[33]表明反向色譜更有利于同類但碳鏈長度不同的神經酰胺的分離。

3.3 神經酰胺的檢測方法

神經酰胺較常用的檢測方法主要有蒸發光散射法、熒光標記熒光檢測法和質譜法。

蒸發光散射法是通過將流動相完全揮發，測定留下來的樣品顆粒的光散射。該方法無流動相干擾，所以結果基線平穩，常與高效液相色譜聯用檢測神經酰胺的含量。該方法已經成功應用于魔芋中神經酰胺的檢測，所得結果重現性良好[34]。熒光標記熒光檢測法是通過一定的衍生化方法使樣品對熒光敏感，從而實現對神經酰胺的間接熒光檢測，常用的熒光試劑包括鄰苯二甲醛和丹磺酰氯等。使用熒光分析神經酰胺類物質發展較快，解決了蒸發光散射法檢測系統靈敏度低的問題[35]。質譜法是通過電場和磁場將樣品按質荷比進行分析，靈敏度較高，是目前發展較快且較常使用的分析方法，可對皮膚、頭發等部位的微量神經酰胺進行檢測[36]。

4 神經酰胺的研究及應用現狀

4.1 在醫藥中的研究及應用現狀

在所有的神經酰胺中，短鏈神經酰胺（C2、C4、C6和C8）細胞滲透性高，無論是單獨還是與傳統的抗癌藥物聯用，都具有很好的抗腫瘤活性[37]?；熕幬飗orinostat和sorafenib通過從頭合成途徑和酸性鞘磷脂酶水解途徑提高細胞內神經酰胺含量，激活內質網應激并誘導腫瘤細胞凋亡[38]。

神經酰胺在心血管疾病中有重要作用，當心肌缺血時神經酰胺含量升高，促進心肌細胞凋亡，防止加重心臟負擔，當心臟再灌注出現時，神經酰胺含量下降，凋亡現象逆轉，心功能改善。低濃度的神經酰胺處理缺血再灌注的小鼠模型可使梗死面積減小，保護心臟[39]。

神經酰胺在皮膚病的治療中也有重要作用，特應性皮炎[40]、濕疹[41]和銀屑病[42]等疾病都是由于皮膚屏障功能受損所致，均表現為神經酰胺含量下降，碳鏈長度變短等。應用加入神經酰胺的藥物治療可顯著增加皮膚含水量，增強皮膚屏障功能。

4.2 在化妝品中的研究及應用現狀

4.2.1 維持和增強皮膚屏障作用機理及其在抗敏化妝品中的應用

神經酰胺在表皮層是通過板層小體將葡萄糖基神經酰胺分解再將其從顆粒層轉運至角質層，在此過程中ATP結合盒轉運子超家族A12（ABCA12）可促進葡萄糖基神經酰胺在板層小體的聚集[43]。并且有研究[44]表明ABCA12缺失會導致丑角樣魚鱗病的發生。含有ω-OH的神經酰胺能共價結合于角化細胞的角化包膜的內披蛋白上，由此將脂質基質和角化細胞連接起來，增強皮膚的屏障功能，減少有害物質通過毛孔、汗腺進入皮膚，從而具有抗敏功效?；ㄍ豕纠闷溟_發的神經酰胺類似物作用于乳酸刺激敏感的患者，4周后患者皮膚狀況均改善，敏感性下降[45]，說明神經酰胺有較強的抗敏功效。

4.2.2 保濕作用機理及其應用

神經酰胺有兩條長鏈烴基（一條是LCB中的碳鏈，一條是FA中的碳鏈），具有疏水性。LCB中的2～3個羥基基團與FA和LCB結合部位的酰胺鍵具有親水性，這兩種性質對其在角質層的保水作用具有重要意義。此外，神經酰胺可明顯促進絲聚合蛋白mRNA和蛋白的表達水平[46]。其中，絲聚合蛋白原從顆粒層進入角質層時，經過一系列酶水解轉化為多羧酸類物質，具有保濕功效。絲聚合蛋白不僅是重要的結構蛋白，而且是保濕因子的主要來源。有研究[47]表明神經酰胺的保濕功效是透明質酸的16倍，為高效保濕劑，易被皮膚吸收，同時能促進其他營養物質滲透，對老年干性皮膚保濕效果高達80%。

4.2.3 抗衰老作用機理及其應用

神經酰胺中的鞘氨醇碳鏈具有雙鍵，且有端位羥基，說明其易氧化使雙鍵斷裂，因此具有抗氧化的作用。有研究[48]表明低濃度的神經酰胺可刺激成纖維細胞增殖，并抑制基質金屬蛋白酶的表達，因此神經酰胺有一定的抗衰老功效。

研究[49]表明水溶性神經酰胺（小麥神經酰胺+雙半乳糖基二酰甘油酯（DGDG））有三重抗衰老功效：一是通過降低水分流失保持表皮的水分；二是激活成纖維細胞的活性，產生膠原蛋白等物質；三是激活基質金屬蛋白酶系列酶抑制劑（TIMP-1）的活性；來源于植物的水溶性神經酰胺對于抑制人體白細胞彈性蛋白酶和膠原蛋白酶也有顯著作用，對抗衰老化妝品的研發有一定的指導意義。

4.2.4 抑制黑色素合成機理及其應用

神經酰胺抑制黑色素合成的機制尚不清楚，但已有關于神經酰胺抑制黑色素合成的研究，并推測其可能是通過抑制細胞外信號調節蛋白激酶（ERK）和Akt/蛋白激酶B（PKB），使黑素細胞中ERK延遲激活大于1 h，PKB延遲激活大于3 h，從而抑制黑色素的合成[50]。目前尚未出現神經酰胺作為美白原料的化妝品，但已有關于其在黑色素瘤方面的研究，它可抑制黑色素瘤細胞，但對正常黑素細胞無損害作用[51]，由此推測神經酰胺應用于傷口或炎癥導致的色素沉著方面可能會有良好的改善作用。

5 結束語

神經酰胺在體內可作為一種結構成分，在角質細胞間起到保濕、抗衰老、抗敏、美白的作用；也可作為信號分子，對細胞的增殖、分化、凋亡起調節作用。外源性神經酰胺應用于化妝品中可增強皮膚屏障作用，用于藥物可與抗癌藥物協同治療癌癥。神經酰胺在化妝品和藥物中的應用具有廣闊的發展前景。

目前神經酰胺主要應用于特應性皮炎、濕疹等皮膚屏障功能障礙性疾病，對于其促進凋亡和抗衰老、美白功效應用較少。我們應進一步探討神經酰胺在化妝品中的應用，通過利用其促進凋亡的作用可以對神經酰胺的濃度、種類進行篩選，從而開發促進增生性痘印消退的產品。另外，神經酰胺種類較多，不同神經酰胺在不同膚質人群中的作用仍有待研究，隨著脂質組學和大數據的發展，將這兩項技術應用于神經酰胺在不同膚質人群的研究，通過數學建模的思想進行不同神經酰胺在不同膚質人群中的預測，可為其在醫藥和化妝品科學領域的應用提供新的方向。