高穩(wěn)定二溴海因水溶液制備及其消毒效果研究

周龍梅，張亮亮，王金燕

（1.山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司上海研發(fā)中心，上海 201203；2.山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司，山東 德州 253032）

二溴海因是一種新型釋放性消毒劑，可應(yīng)用于家庭清潔消毒，具有廣譜高效、無毒低味、安全環(huán)保等特點(diǎn)[1-4]。文獻(xiàn)[5， 6]表明二溴海因中的有效溴是殺滅微生物的主要成分，其在水溶液中能與水反應(yīng)生成強(qiáng)氧化性的次溴酸和游離溴，將微生物體內(nèi)的生物酶氧化分解而失效，從而達(dá)到殺滅微生物的效果，是比較理想的家用殺菌劑。

由于二溴海因20 ℃在水中溶解度低（0.1 g/100 mL）、溶解速度慢、溶解后穩(wěn)定性差且只能以固體形態(tài)存儲(chǔ)使用等缺陷導(dǎo)致其應(yīng)用受到限制。徐麗君等[7]研究表明二溴海因在含氮和含氧的溶劑如尿素、乙醇、二甲基乙酰胺、乙腈等中有較好的溶解度，但除了乙腈外，二溴海因在其他溶劑中不穩(wěn)定，而乙腈具有一定的毒性。劉臘芹等[8]制備了二溴海因/二氧化硅復(fù)合粒子，該復(fù)合粒子有助于二溴海因在水中分散，從而提高二溴海因的殺菌效果，不過該產(chǎn)品仍是一款固體產(chǎn)品。筆者采用穩(wěn)定劑氨基磺酸及助溶劑三聚磷酸鈉、酸堿調(diào)節(jié)劑磷酸三鈉與純化水、二溴海因制成水溶液，研究其水溶液的穩(wěn)定性和殺菌性，為其推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、大腸桿菌（ATCC 8099）、銅綠假單胞菌（ATCC 15442）、白色念珠菌（ATCC 10231），中國普通微生物菌種保藏中心提供。

胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）及胰蛋白胨生理鹽水（TPS）稀釋液，青島海博生物技術(shù)有限公司。

有機(jī)干擾物：質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%牛血清白蛋白（BSA），河南一褀生物技術(shù)有限公司；中和劑：D/E中和肉湯，美國BD公司；標(biāo)準(zhǔn)硬水，硬度342 mg/L。

二溴海因（化學(xué)名：1，3-二溴-5，5-二甲基乙內(nèi)酰脲，1，3-二溴-5，5-二甲基海因，英文縮寫DBDMH，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%），河北鑫陶源環(huán)保科技有限公司；氨基磺酸（AR，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.5%）、三聚磷酸鈉（CP）、磷酸三鈉（無水CP，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為純化水。

UV1801型紫外/可見分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 二溴海因水溶液制備

將氨基磺酸、三聚磷酸鈉、磷酸三鈉及二溴海因按質(zhì)量比5∶10∶3∶2.5稱量，將氨基磺酸、三聚磷酸鈉、磷酸三鈉加入純化水中攪拌溶解，再將二溴海因加入上述混合溶液，攪拌溶解制備質(zhì)量濃度為25.3 g/L的淺黃色透明二溴海因溶液。

1.2.2 二溴海因含量測(cè)定

二溴海因含量測(cè)定參考國標(biāo)GB/T 23849-2009。精密量取二溴海因水溶液樣品5 mL，置于加有125 mL純化水、2 g碘化鉀的250 mL碘量瓶中，電磁攪拌器上充分?jǐn)嚢瑁箻悠吠耆芙狻＜? mol /L硫酸溶液20 mL，用20 mL蒸餾水沖洗瓶口及瓶壁，迅速加蓋水封，置暗處5 min，然后用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液滴定，至溶液變淡黃色，加淀粉指示劑繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失，記錄耗用的硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（同時(shí)作空白）。計(jì)算公式為：

式中，ρ為二溴海因質(zhì)量濃度，g/L；V1為消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL；V2為空白滴定消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；V為量取樣品的體積，mL；c為硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液摩爾濃度，mol/L。

1.2.3 穩(wěn)定性測(cè)定

將包裝完好的二溴海因水溶液置于37 ℃恒溫箱內(nèi)放置90天，于放置前、后分別測(cè)定二溴海因含量。

1.2.4 懸液定量殺菌實(shí)驗(yàn)

懸液定量殺菌實(shí)驗(yàn)參考2002年版《消毒技術(shù)規(guī)范》。

菌懸液制備：剛培養(yǎng)完的斜面，用3～4 mL TPS洗菌，根據(jù)實(shí)際菌落數(shù)用TPS進(jìn)行適當(dāng)稀釋，體積比1∶1的菌液與BSA混合成菌懸液。懸液法回收菌落數(shù)1×107～5×107CFU /mL金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌及1×106～5×106CFU /mL白色念珠菌。

實(shí)驗(yàn)組：取1 mL菌懸液加入4 mL消毒液中計(jì)時(shí)，計(jì)時(shí)結(jié)束后，取0.5 mL加入4.5 mL D/E中和肉湯中，劇烈振蕩，中和10 min。適當(dāng)稀釋進(jìn)行接種，37 ℃培養(yǎng)48 h。

陽性對(duì)照組：取0.5 mL菌懸液加入4.5 mL TPS中，用TPS進(jìn)行10倍稀釋，選擇適當(dāng)稀釋梯度進(jìn)行接種，37 ℃培養(yǎng)48 h。

計(jì)算各組活菌濃度（CFU/mL）及殺滅對(duì)數(shù)值。

1.2.5 現(xiàn)場(chǎng)消毒實(shí)驗(yàn)

現(xiàn)場(chǎng)消毒實(shí)驗(yàn)參考2002年版《消毒技術(shù)規(guī)范》。

消毒前，將2只無菌棉拭子于含5 mL的TPS試管中沾濕，對(duì)5 cm×5 cm區(qū)塊涂抹采樣，橫豎往返各8次。采樣后，以無菌操作方式將棉拭子采樣端剪入原TPS試管內(nèi)，振蕩20 s或振打80次，適當(dāng)稀釋后作為陽性對(duì)照組樣本。每個(gè)樣本接種2個(gè)平皿，放37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h。

將25.3 g/L的二溴海因水溶液用標(biāo)準(zhǔn)硬水稀釋成二溴海因質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的消毒液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

用消毒液擦于物體表面進(jìn)行消毒，消毒后將2只無菌棉拭子于含5 mL D/E中和肉湯試管中沾濕，對(duì)消毒區(qū)塊涂抹采樣，橫豎往返各8次。采樣后，以無菌操作方式將棉拭子采樣端剪入原采樣液試管內(nèi)，電動(dòng)混勻器振蕩20 s或振打80次，作為消毒組樣本。每個(gè)樣本接種2個(gè)平皿，放37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h。

對(duì)消毒前后采樣標(biāo)本進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算殺滅對(duì)數(shù)值。

2 結(jié)果與討論

2.1 二溴海因水溶液紫外吸收光譜

涂文利等[9]研究發(fā)現(xiàn)硫酸銨、氨基磺酸對(duì)次氯酸鈉溶液有穩(wěn)定作用，用紫外分光光度計(jì)對(duì)含有硫酸銨、氨基磺酸的次氯酸鈉溶液掃描，發(fā)現(xiàn)在波長(zhǎng)245 nm處有吸收峰，表明有氯胺活性物生成。次氯酸鈉溶液中的有效氯與氮原子形成新的共價(jià)鍵，從而穩(wěn)定溶液中的次氯酸鈉。筆者研究發(fā)現(xiàn)氨基磺酸對(duì)水溶液中的二溴海因也有穩(wěn)定作用，而硫酸銨不具有穩(wěn)定作用。取1.2.1制備的二溴海因水溶液1 g加入到99 g純化水中進(jìn)行稀釋，稀釋液進(jìn)行紫外吸收光譜測(cè)定（圖1a）；按照制備二溴海因水溶液添加比例，將氨基磺酸、三聚磷酸鈉、磷酸三鈉用純化水溶解，取溶液1 g加入到99 g純化水中進(jìn)行稀釋，稀釋液進(jìn)行紫外吸收光譜測(cè)定（圖1b）；取0.025 g二溴海因加入到499.975 g純化水中溶解進(jìn)行紫外吸收光譜測(cè)定（圖1c），以上3種溶液均以實(shí)驗(yàn)用純化水作參比。由圖1可知，a曲線在280 nm處有吸收峰，而b曲線和c曲線在此處都沒有吸收峰。這說明二溴海因中的部分活性溴與氨基磺酸中的氮形成穩(wěn)定共價(jià)鍵，因此減緩了二溴海因中活性溴的釋放，使得二溴海因在水溶液中的穩(wěn)定性加強(qiáng)。

2.2 二溴海因水溶液穩(wěn)定性

由穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)可知，存放前的二溴海因溶液質(zhì)量濃度為25.3 g/L，37 ℃恒溫箱放置90天后二溴海因溶液質(zhì)量濃度為23.7 g/L，二溴海因含量的下降率僅為6.3%。

圖1 紫外吸收光譜圖Fig.1 UV absorption spectra

2.3 二溴海因的殺菌效果

將質(zhì)量濃度25.3 g/L的二溴海因水溶液用標(biāo)準(zhǔn)硬水稀釋成含二溴海因質(zhì)量濃度分別為625，1 250及3 125 mg/L的消毒液進(jìn)行殺菌實(shí)驗(yàn)；將37 ℃恒溫箱內(nèi)放置90天后質(zhì)量濃度為23.7 g/L的二溴海因水溶液用標(biāo)準(zhǔn)硬水稀釋成二溴海因質(zhì)量濃度為1 250及3 125 mg/L的消毒液進(jìn)行殺菌實(shí)驗(yàn)，測(cè)試結(jié)果見表1，表中二溴海因質(zhì)量濃度為稀釋后的實(shí)際使用濃度。

表1 二溴海因消毒效果Tab.1 Disinfection effect of DBDMH

第1組和第2組實(shí)驗(yàn)是新鮮配制的不同濃度的消毒液殺菌實(shí)驗(yàn)，質(zhì)量分?jǐn)?shù) 3%的牛血清白蛋白為干擾物。由表1結(jié)果可知，含二溴海因質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的消毒液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌菌懸液作用10 min，對(duì)其殺滅對(duì)數(shù)值均大于5.0；含二溴海因質(zhì)量濃度為2 500 mg/L的消毒液對(duì)白色念珠菌作用10 min，對(duì)其殺滅對(duì)數(shù)值大于4.0；含二溴海因500 mg/L的消毒液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌菌懸液作用10 min，對(duì)其殺滅對(duì)數(shù)值都大于5.0，而對(duì)銅綠假單胞菌菌懸液的殺滅對(duì)數(shù)值小于5.0，達(dá)不到2002年版《消毒技術(shù)規(guī)范》的要求；含二溴海因1 000 mg/L的消毒液對(duì)白色念珠菌作用10 min，對(duì)其殺滅對(duì)數(shù)值小于4.0，達(dá)不到2002年版《消毒技術(shù)規(guī)范》的要求。

第3組實(shí)驗(yàn)為37 ℃恒溫箱內(nèi)放置90天后的消毒液殺菌實(shí)驗(yàn)，質(zhì)量分?jǐn)?shù) 3%的牛血清白蛋白為干擾物。結(jié)果表明，消毒液經(jīng)過老化后對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌菌懸液作用10 min，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及銅綠假單胞菌的殺滅對(duì)數(shù)值都大于5.0，對(duì)白色念珠菌的殺滅對(duì)數(shù)值大于4.0。相對(duì)于新鮮配制的消毒液，其殺菌效果有所下降，但能達(dá)到2002年版《消毒技術(shù)規(guī)范》的要求。

二溴海因液體消毒產(chǎn)品，相對(duì)于粉劑或片劑二溴海因消毒產(chǎn)品溶于水形成消毒劑來說，其水溶液中二溴海因中部分活性溴與氨基磺酸分子中的氮原子形成穩(wěn)定共價(jià)鍵，減緩了二溴海因中活性溴的釋放，導(dǎo)致水溶液中活性溴濃度較低，殺菌效果差。提高其濃度，增加活性溴釋放，其殺菌效果才能達(dá)到2002年版《消毒技術(shù)規(guī)范》的要求。

2.4 物體表面現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

按照1.2.5進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)消毒實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知，消毒液對(duì)物體表面自然菌的平均殺滅對(duì)數(shù)值為1.19，符合2002年版《消毒技術(shù)規(guī)范》中對(duì)普通物體表面消毒液的要求。

表2 現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)Tab.2 The results of spot test

3 結(jié)論

1）以氨基磺酸為穩(wěn)定劑制成的質(zhì)量濃度為25.3 g/L的二溴海因的水溶液，該水溶液經(jīng)過紫外分光光度計(jì)全光波掃描在波長(zhǎng)280 nm處有吸收峰，表明在水溶液中氨基磺酸中氮原子與二溴海因分子中部分活性溴形成共價(jià)鍵，從而緩解活性溴的釋放，使得二溴海因在水溶液中的穩(wěn)定性加強(qiáng)。

2）穩(wěn)定性測(cè)試、懸液法定量殺菌測(cè)試以及現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該水溶液穩(wěn)定性符合2002年版《消毒技術(shù)規(guī)范》對(duì)消毒液的要求；對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌及白色念珠菌有消毒作用，對(duì)自然菌也具有消毒作用，符合2002年版《消毒技術(shù)規(guī)范》對(duì)用于普通物體表面消毒液的要求。