LC-MS/MS法測定蜂膠類牙膏中白楊黃素的含量

韓雅楠，蘇慧鋒

（烏海職業技術學院 化工系，內蒙古 烏海 016000）

蜂膠是工蜂從植物體上采集的樹脂和與其上顎腺、蠟腺的分泌物混合而形成的具有粘性、芳香氣味的固體膠狀物質[1，2]，其主要化學成分為黃酮類化合物，其中白楊黃素（chrysin，ChR）在蜂膠中含量較高[3，4]。ChR又稱白楊素、5，7-二羥黃酮，可從多種植物（木蝴蝶、山柏松、芒松）、蜂蜜和蜂膠中提取的一種天然黃酮類化合物，具有抗菌、消炎、降血脂、抗糖尿病、抗氧化和防心腦血管疾病等[5-8]，對腫瘤細胞具有抑制增殖和誘導凋亡等抗腫瘤活性，常以蜂膠提取物形式被添加到食品、藥品和化妝品中，尤其是各種功效型牙膏，用以預防或減輕牙菌斑、牙齦腫痛、口腔潰瘍和口臭等口腔問題。QB/T 2966-2014《功效型牙膏》和國家食品藥品監督管理總局公告《化妝品功效宣稱評價指導原則》（征求意見稿）中關于功效評價及安全性要求，功效成分應進行定性或定量檢測。

目前關于ChR的檢測方法主要為高效液相色譜法（HPLC）[9-14]，該法具有簡便易用、效率高，但易受雜質干擾、靈敏度不高，且檢測的ChR對象主要為蜂膠，而關于蜂膠類牙膏等復雜基質中ChR的檢測報道較少。液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）是將液相色譜儀的高效分離能力與質譜儀的強組分鑒定能力結合，是有效分離分析復雜混合物的可靠方法，關于LC-MS/MS法測定ChR的報道較少[15，16]。本文采用甲醇提取蜂膠類牙膏中ChR，冷凍離心凈化，經Diamonsil C18色譜柱分離，質譜檢測器檢測，建立LC-MS/MS法測定蜂膠類牙膏中ChR的含量，以期為蜂膠類牙膏中功效成分ChR的定性或定量提供檢測方法。

1 實驗部分

1.1 主要試劑與儀器

ChR （CAS 480-40-0，分子式C15H10O4，分子量254.24，純度99.9%，20 mg），色譜純，成都普瑞法科技開發有限公司；甲醇、乙腈、丙酮、異丙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷、乙酸銨，色譜純，美國TEDIA公司；其余所用試劑均為分析純，上?；瘜W試劑廠；8種不同品牌的功效型牙膏，購自蘇寧易購網上商城。

Waters ACQUITY UPLC/ Xevo TQ MS型超高效液相色譜-串聯質譜儀，美國Waters公司；CPA324S型電子天平，德國Sartorius公司；SK8300BT型超聲清洗器，上海漢克科學儀器有限公司；Milli-Q型超純水器，美國Millipore公司；vortex-genie2型渦旋混合器，美國Scientific Industries公司；5427R高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；Syncore Polyvap多樣品平行蒸發儀，瑞士BUCHI公司。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取ChR標準物質10 mg（精確到0.1 mg），置于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容配制成質量濃度為1 g/L的標準儲備液。取ChR標準儲備液適量，用乙腈逐級稀釋得到質量濃度依次為5.0，10.0，25.0，50.0和100.0 μg/L的標準工作溶液。

1.3 LC-MS/MS條件

液相色譜條件：色譜柱為Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL；流速為0.3 mL/min；流動相A為0.2 mmol/L 乙酸銨溶液；流動相B為乙腈。梯度洗脫程序：0～5.0 min，20%～80%B；5.0～7.0 min，80%～100% B；7.0～7.1 min，80% B；7.1～10.0 min，80%～20% B。

質譜條件：采用電噴霧離子化負離子采集模式（ESI-）；離子源溫度120 ℃；脫溶劑溫度350 ℃；毛細管電壓3.5 kV；脫溶劑氣為N2，600 L/h；錐孔氣N2，50 L/h；碰撞氣Ar，0.06 mL/min；檢測方式為多反應監測（MRM）；定性離子對（m/z）為253.2/172.1；定量離子對（m/z）為253.2/120.2；錐孔電壓20 V；碰撞能量25 V。

1.4 樣品前處理

準確稱取蜂膠類牙膏2.0 g（精度0.1 mg），置于50 mL離心管中，加入2 mL飽和氯化鈉溶液，渦旋30 s分散均勻，加入20 mL 甲醇，渦旋30 s分散均勻后超聲提取30 min，10 000 r/min冷凍離心10 min，收集上清液；殘渣用20 mL甲醇再渦旋混勻超聲提取30 min，10 000 r/min離心10 min，合并上清液，45 ℃旋轉蒸發至干，用1 mL乙腈渦旋溶解后，經0.22 μm有機濾膜過濾，供LC-MS/MS檢測。

2 結果與討論

2.1 質譜條件優化

采用蠕動泵以1.0 μL/min的流速將1.0 mg/L ChR標準工作溶液連續注入ESI離子源中，分別進行正負離子檢測方式對ChR進行一級質譜分析（母離子掃描）；對準分子離子峰進行二級質譜分析（子離子掃描）。結果表明：在負離子檢測方式下，獲得準分子離子[M-H]-信號較強（m/z 253.2），且干擾較小，這可能與ChR分子結構中羥基易失去H有關；對準分子離子[M-H]-進行子離子掃描，以得到的豐度較大的兩個碎片離子m/z 172.1和m/z 120.2作為定性離子，以其中豐度較大的碎片離子m/z 120.2作為定量離子（見圖1）。

圖1 ChR的二級質譜圖Fig.1 Secondary mass spectrum of chrysin

2.2 色譜柱的選擇

考察了Waters BEH C18、X Bridge C18、Diamonsil C18、Zorbox SB C18、Shim-pack VP-ODS C18等不同液相色譜柱對蜂膠類牙膏中ChR的分離效果。結果表明：在相同流動相的前提下，采用Diamonsil C18色譜柱能夠提供較好的分離效果，ChR色譜峰峰形對稱，保留時間5.32 min適中，質譜響應值較高（見圖2），故選擇Diamonsil C18作為色譜分析柱。

圖2 ChR標準工作溶液總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of chrysin standard solution

2.3 流動相的選擇

考察了不同流動相體系（甲醇/乙腈-水、甲醇/乙腈-醋酸水溶液、甲醇/乙腈-磷酸緩沖液、甲醇/乙腈-乙酸銨溶液）對目標物ChR的分離效果和離子化效率的影響。結果顯示：乙腈作為有機相對ChR的分離效果優于甲醇；流動相體系中酸度越強，采用正離子模式檢測的化合物相應越高，采用負離子模式檢測的化合物相應受到抑制。在負離子檢測方式下，選擇以乙腈-水為流動相時，ChR出現峰展寬及拖尾現象，這可能是由于ChR結構中2個羥基與C18色譜柱中的硅羥基發生弱離子交換作用，從而導致峰展寬及拖尾現象；選擇以乙腈-乙酸銨溶液為流動相時，ChR的分離效果明顯改善，尤其是以乙腈-0.2 mmol/L 乙酸銨為流動相對ChR進行洗脫，ChR的分離效果良好，色譜峰峰形對稱，且響應值較高。故選擇乙腈-0.2 mmol/L 乙酸銨溶液作為流動相。

2.4 提取和凈化方式的選擇

考察了甲醇、乙腈、丙酮、異丙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷和正己烷等不同提取溶劑對蜂膠類牙膏中ChR的提取效果及凈化方式的選擇。結果顯示：ChR可溶于甲醇、乙腈、丙酮、異丙醇和乙酸乙酯中，微溶于二氯甲烷和正己烷；依據不同提取溶劑對ChR提取回收率高低排序為：丙酮（97.8%）＞甲醇（97.2%）＞乙腈（92.1%）＞異丙醇（86.4%）＞乙酸乙酯（81.3%）＞二氯甲烷（62.8%）＞正己烷（51.3%），其中丙酮對ChR的提取回收率最高，但丙酮萃取液存在部分雜質峰或干擾峰；而甲醇對ChR的提取回收率為97.2%，雜質峰或干擾峰較少，但提取后存在提取液起泡現象；采用添加飽和氯化鈉溶液可消除提取液起泡現象，且經冷凍離心可將提取溶液與蜂膠類牙膏基質中碳酸鈣、磷酸氫鈣、二氧化硅等成分有效分離，減少對ChR的干擾。故選擇甲醇作為提取溶劑及冷凍離心凈化方式。

2.5 基質效應的考察

為避免蜂膠類牙膏基質對LC-MS/MS法測定ChR過程中的影響或干擾，采用標準加入法計算基質效應（matrix effect，ME），ME=（B/A-1）×100%，式中，A為純乙腈基質中ChR的響應值，B為空白蜂膠類牙膏基質中ChR的響應值。當ME＞10%，說明存在基質增強效應；當-10%＜ME＜10%，說明不存在基質效應；當ME＜-10%時，說明存在基質減弱效應。結果顯示：在純乙腈和空白蜂膠類牙膏中加入5.0，50.0和100.0 μg/L低中高3種質量濃度的ChR標準溶液，按1.4節進行樣品前處理，經LC-MS/MS法測定ChR的ME值分別為-3.8%，-1.7%和1.2%，這說明蜂膠類牙膏基質對LC-MS/MS法測定ChR不存在基質效應。

2.6 線性范圍、相關系數、檢出限及定量限

用不含待測物的空白基質溶液配制一系列ChR標準樣品進行LC-MS/MS測定，以ChR質譜響應值（y）為縱坐標，ChR質量濃度（x）為橫坐標，繪制標準曲線；在不含目標物的空白基質牙膏中添加一系列低質量濃度的ChR標準溶液，平行測定20次，以信噪比S/N=3計算方法檢出限（LODs），信噪比S/N=10計算方法定量限（LOQs）。結果顯示：ChR在5.0～100.0 μg/L質量濃度范圍內呈現良好的線性關系，線性回歸方程為y=7.04×106x+3.16×105，相關系數（R2）為0.999 8；LODs為1.5 μg/kg，LOQ為5.0 μg/kg。

2.7 加標回收率和精密度

在3份不同的蜂膠類牙膏樣品中分別添加5.0，50.0和100.0 μg/kg低中高3種濃度水平的ChR標準溶液進行加標回收率和精密度實驗，結果見表1。從表1中可知，ChR在加標濃度5.0～100.0 μg/kg范圍內，蜂膠類牙膏中ChR加標回收率測定值在86.7%～102.9%，平均回收率在93.0%～100.1%，相對標準偏差（RSD）在1.3%～3.4%。

表1 加標回收率和精密度（n=6）Tab.1 Recoveries and precision（n=6）

2.8 實際樣品的測定

針對隨即選購的8份不同品牌蜂膠類牙膏（新西蘭Red seal紅印蜂膠牙膏、德國Paul-dent寶兒德蜂膠牙膏、澳大利亞Healthy Care蜂膠牙膏、紐西小精靈蜂膠薄荷牙膏、高露潔蜂膠舒齦牙膏、納諾神蜂蜂膠功效抑菌皓白牙膏、皓藍蜂膠茶潔牙膏和CEDEL時達樂蜂膠牙膏）按本文所建LC-MS/MS法測定蜂膠類牙膏中ChR的含量。結果顯示：8份受檢蜂膠類牙膏中，7份樣品檢出含有ChR （見圖3），ChR檢出率共計87.5%；檢出ChR的蜂膠類牙膏產品成分中均注明含有蜂膠提取物，功效主要為：清新口氣、多重功效、牙齦護理、抗敏感，部分產品外包裝上印有蜂巢圖案，這說明所檢市售蜂膠類牙膏中大部分生產商都通過添加蜂膠提取物來添加ChR，以達到清新口氣、多重功效，符合QB/T 2966-2014《功效型牙膏》中功效型牙膏中添加的功效成分應進行定性或定量測定的要求。

圖3 實際樣品總離子流圖Fig.3 Total ion chromatograms of actual samples

2.9 與現有檢測方法的比較

從線性范圍、加標回收率、相對標準偏差（RSD）、檢出限和定量限等方法學參數，將本文所建LC-MS/MS法與現有標準、科學文獻等報道的檢測方法進行比較，結果見表2。從表2中可知，現有檢測ChR的方法均具有較高的加標回收率和RSD；與HPLC法相比，質譜法（LC-MS或LC-MS/MS）的靈敏度更高；本文所建LC-MS/MS法具有加標回收率高、檢出限低、精密度好等特點。

表2 不同檢測方法的比較Tab.2 Comparison of different analysis methods

3 結論

建立了LC-MS/MS法測定蜂膠類牙膏中ChR含量的方法。結果表明，ChR在5.0～100.0 μg/L質量濃度范圍內呈現良好的線性關系，相關系數（R2）為0.999 8；LODs為1.5 μg/kg，LOQ為5.0 μg/kg；平均加標回收率在93.0%～100.1%，相對標準偏差（RSD）在1.3%～3.4%。該法靈敏度高、準確度高、操作簡便，可為功效型牙膏生產企業及其行政監管部門提供ChR檢測方法。