花青素通過TLR4/NF－κB通路對脂多糖誘導的血管內(nèi)皮損傷的保護作用

陳 惠，胡 勇

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是多種心腦血管疾病的主要病理基礎，現(xiàn)已嚴重危害到人類的健康［1］。 大量基礎和臨床研究表明［2］，動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，是血管壁對各種損傷的一種異常反應，具有經(jīng)典炎癥變性、滲出及增生的特點。炎癥反應貫穿動脈粥樣硬化發(fā)病的各個階段，可能是多種致動脈粥樣硬化因素致病機制的共同環(huán)節(jié)或通路。炎癥機制不但與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展有關，而且與動脈粥樣硬化的多種并發(fā)癥的發(fā)生密切相關。動脈粥樣硬化的炎癥類型包括生物性炎癥、免疫性炎癥和化學性炎癥。動脈粥樣硬化發(fā)病初期主要表現(xiàn)為急性滲出性炎癥，而在進展期主要表現(xiàn)出慢性增生性炎癥的特點。炎癥反應中涉及多種炎癥細胞、炎性細胞因子、炎性介質(zhì)、黏附分子、趨化因子、生長因子等。現(xiàn)已證明，多種抗動脈粥樣硬化藥物具有抗炎作用，抗感染治療已成為防治動脈粥樣硬化的一種新途徑。

花青素是一種存在于植物性食物中的具有生物活性的化合物，存在于植物的葉、莖、花和果實中，具有多種藥理作用。研究表明［3］，花青素具有抗氧化、清除自由基、抗炎等作用，花青素其有效成分對內(nèi)皮細胞有顯著保護作用，從而防止和減輕相關疾病發(fā)生發(fā)展過程中的內(nèi)皮功能障礙。該研究以脂多糖（LPS）誘導內(nèi)皮細胞損傷作為模型，研究花青素對血管內(nèi)皮細胞保護作用及相關機制。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物 花青素，純度≥98%，購自南京景竹生物科技有限公司。

1.2 細胞 人臍靜脈內(nèi)皮細胞 （HUVECs），購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.3 試劑 胎牛血清購自四季青公司、含0.25%EDTA的胰酶和高糖DMEM細胞培養(yǎng)購自美國Hyclone公司；MTT試劑盒購自北京solaibio公司；乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽（GSH）試劑盒購自南京建成生物公司；一氧化氮（NO）合酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購自上海研謹生物公司；IL-6、TNF-α （ELISA）試 劑 盒 （Beijing Cheng Lin Biological Technology）；二氫乙錠（ DHE，美國 AAT Bioquest公司）；抗體TLR4，NF-κB購自沈陽萬類生物科技公司；HRP標記II抗購自美國Earthox公司；β-actin購自美國SAB公司；ECL化學發(fā)光試劑購自沈陽萬類生物科技公司。

1.4 儀器 TC2323型二氧化碳孵箱 （美國SheldonManufacturing公司），XD-101型倒置顯微鏡（日本Olympus公司），79-1型磁力加熱攪拌器 （江蘇金壇中大儀器廠），Leica DM1000型熒光顯微鏡（德國Leica公司），BS-124S型電子天平（德國賽多利斯天平有限公司），DNM-9602G型酶標分析儀（北京普朗新技術有限公司），流式細胞儀（美國伯樂），電泳儀、化學發(fā)光成像儀（Bio-Rad公司）。

1.5 方 法

1.5.1 細胞培養(yǎng)及分組 復蘇HUVECs，培養(yǎng)在高糖DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%抗生素），在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，待細胞達到80%左右的融合度時，用0.25%胰蛋白酶消化并傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。實驗分組：空白對照組（只給予培養(yǎng)基）；模型組（培養(yǎng)基中加入1000 ng/ml脂多糖孵育24 h）；花青素組 ［培養(yǎng)基中分別先加入100，50，25（μg/ml）濃度的花青素孵育 12 h，再加入1000 ng/ml脂多糖孵育24 h］。

1.5.2 MTT法檢測細胞活力 取對數(shù)生長期的HUVECs，0.25%胰蛋白酶消化，以 1×105個/ml為接種密度、每孔100 μl接種于96孔培養(yǎng)板中。按1.5.1的分組及給藥方法培養(yǎng)后，傾去培養(yǎng)液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液 90 μl，MTT 10 μl（5 g/L），繼續(xù)培養(yǎng)4 h；然后棄上清，每孔加入100 μl DMSO，搖床震搖15 min，在酶標儀492 nm波長處測定吸光度值。根據(jù)每組細胞的OD值計算細胞活力。

1.5.3 DHE熒光探針檢測HUVECs中ROS的變化獲取對數(shù)生長期的HUVECs并以1×105個/孔容量接種于6孔板中。分組及給藥同1.5.1，作用24 h后，棄去上清，用PBS洗3次，加入10 μmol/L的DHE，37℃孵育30 min，在熒光顯微鏡下觀察。使用Imge-pro plus 6軟件進一步分析生產(chǎn)結果。結果以相對熒光強度的單位表示。

1.5.4 ELISA法檢測一氧化氮（NO）、TNF-α和IL-6的含量 收集各組細胞上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測細胞上清液一氧化氮（NO）、TNF-α和IL-6的含量，將試劑盒置于室溫平衡30 min，按照ELISA試劑盒說明進行操作，完畢后全自動酶標儀在450 nm讀取A，繪制標準曲線，根據(jù)各標本A算出相應的濃度。

1.5.5 HUVECs抗氧化指標測定 收集各組細胞培養(yǎng)液上清，利用比色法按照試劑盒說明方法分別檢測各組細胞中LDH、MDA、SOD、GSH-PX含量變化。

1.5.6 免疫印跡法測定蛋白表達 按照實驗設計處理完各組細胞后，棄去上清，收集各組細胞，加入200 μl蛋白裂解液（含 1%PMSF），冰上反復吹打，4℃，12 000 g離心15 min，取上清，通過BCA法進行蛋白定量。制備12%分離膠，5%濃縮膠，SDSPAGE電泳，上樣量為40 μg/20 μl。半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。3%BSA 室溫封閉 1.5 h。TLR4，NF-κB一抗（1∶1000），4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜 3 遍，辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶5000）室溫孵育1.5 h，再次TBST洗膜3遍，ECL化學發(fā)光顯影拍照，凝膠成像儀檢測。

1.5.7 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17．0進行統(tǒng)計分析，計量資料采用（±s）表示。在方差齊性條件下多組間比較采用單因（One-wayANOVA）分析，多組間的兩兩比較采用t檢驗。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 花青素對脂多糖（LPS）作用后HUVECs活力的影響 MTT檢測發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，模型組（脂多糖損傷組）活力顯著降低（P＜0．01）；與模型組（脂多糖損傷組）相比，花青素組細胞活力隨濃度梯度增高逐漸上升（P＜0．01）?；ㄇ嗨貪舛葟?100 μg/ml至150 μmol/L對細胞活力無明顯影響。實驗結果說明花青素可以增強HUVECs的活力（表1）。

表1 花青素對細胞活力的影響（n=5，±s）

表1 花青素對細胞活力的影響（n=5，±s）

注：與脂多糖損傷組比較，＊P＜0．05，#P＜0．01。

分組 細胞活力（%）空白組（對照組）99．5±5．6#脂多糖損傷組（模型組）51．3±3．1花青素組（25 μg/ml）63．4±3．8＊花青素組（50 μg/ml）76．9±4．6#花青素組（100 μg/ml）88．5±5．1#花青素組（150 μg/ml）88．2±5．2

2.2 花青素對脂多糖（LPS）作用后HUVECs ROS的影響 DHE熒光探針檢測顯示，模型組（脂多糖損傷組）HUVECs產(chǎn)生大量ROS，明顯高于空白對照組（P＜0．01）。 而花青素組 ROS 含量逐漸降低（P＜0．01）。實驗表明，花青素可以在脂多糖（LPS）作用后減少HUVECs中ROS的產(chǎn)生（表2）。

2.3 花青素對脂多糖（LPS）作用后HUVECs功能因子和炎性因子的影響 ELISA方法檢測花青素對脂多糖（LPS）作用后HUVECs培養(yǎng)上清液中NO、TNF－α和IL－6含量變化（表3）。檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組 （脂多糖損傷組）HUVECs上清中NO含量顯著下降，TNF－α和IL－6含量顯著上升（P＜0．01）；而不同濃度花青素組細胞上清液中NO含量隨濃度梯度逐漸上升，TNF－α和IL－6含量逐漸下降，呈現(xiàn)一定的濃度依賴性保護作用（P＜0．01）。

表2 花青素對細胞ROS的影響（n=5，±s）

表2 花青素對細胞ROS的影響（n=5，±s）

注：與脂多糖損傷組比較，＊P＜0．05，#P＜0．01。

分組 ROS（MFI）空白組（對照組）52．6±6．7#脂多糖損傷組（模型組）223．8±29．4花青素組（25 μg/ml）165．3±24．1＊花青素組（50 μg/ml）101．5±13．4#花青素組（100 μg/ml）74．7±5．8#

表3 花青素對細胞功能因子和炎性因子的影響（n=5，±s）

表3 花青素對細胞功能因子和炎性因子的影響（n=5，±s）

注：與脂多糖損傷組比較，＊P＜0．05，#P＜0．01。

分組 NO（μmol/L） TNF－α（pg/ml） IL－6（pg/ml）空白組（對照組）87．5±8．3# 143．4±22．3# 53．5±13．7#脂多糖損傷組（模型組）35．3±14．6 377．9±25．4 164．1±23．2花青素組（25 μg/ml）51．7±13．2＊ 338．6±31．5＊ 143．7±20．5＊花青素組（50 μg/ml）62．3±7．1# 272．8±37．1# 104．3±16．1#花青素組（100 μg/ml）75．2±12．1# 196．1±19．8# 71．2±9．7#

2.4 花青素對脂多糖 （LPS）作用后HUVECs LDH、MDA、SOD和GSH-PX的影響 經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)（表4），與空白對照組相比，脂多糖損傷組LDH、MDA含量顯著增加，SOD、GSH－PX活性顯著下降（P＜0．01）；當不同濃度花青素作用于脂多糖氧化損傷后的HUVECs時，各組LDH、MDA含量逐漸下降，SOD、GSH－PX 活性逐漸上升（P＜0．01）。

2.5 花青素對脂多糖（LPS）作用后TLR4，NF-κB蛋白表達的影響 Western blot分析顯示，模型組HUVECs細胞中 TLR4，NF－κB蛋白的表達明顯高于空白對照組，而不同濃度的花青素組中以上2種蛋白表達逐漸降低（P＜0．01，表 5）。 因此，花青素對內(nèi)皮細胞保護作用與TLR4/NF－κB通路密切相關。

3 討 論

脂多糖是革蘭陰性桿菌細胞壁的主要成分，通過脂多糖結合蛋白（LBP）運送后，與各類細胞質(zhì)膜上的CD14結合，CD14與LPS-LBP復合體結合后，通過Toll樣受體4（TLR4）激活NF-κB信號通路。信號級聯(lián)反應致使炎癥細胞因子如IL-6和TNF-α的釋放［4］。

表4 花青素對細胞LDH、MDA、SOD和GSH-PX的影響（n=5，±s）

表4 花青素對細胞LDH、MDA、SOD和GSH-PX的影響（n=5，±s）

注：與脂多糖損傷組比較，＊P＜0．05，#P＜0．01。

分組 LDH（U/L）MDA（nmol/mg）SOD（U/mg）GSH－PX（U/mg）空白組（對照組）233．5±44．7# 2．14±0．23# 35．8±2．7# 126．8±18．4#脂多糖損傷組（模型組）914．6±123．9 4．43±0．29 14．3±1．6 60．7±13．1花青素組（25 μg/ml）731．8±145．1＊ 3．65±0．48＊ 19．8±3．1＊ 82．4±16．7＊花青素組（50 μg/ml）583．2±162．3# 2．82±0．22# 24．7±4．5# 104．9±13．9#花青素組（100 μg/ml）314．5±208．5# 2．41±0．25# 30．4±1．9# 60．4±14．6#

表5 花青素對細胞TLR4，NF-κB蛋白表達的影響（n=5，±s）

表5 花青素對細胞TLR4，NF-κB蛋白表達的影響（n=5，±s）

注：與脂多糖損傷組比較，＊P＜0.05，#P＜0.01。

分組 TLR4/β-actin NF-κB/β-actin空白組（對照組）0.23±0.12# 0.32±0.19#脂多糖損傷組（模型組）1.01±0.17 1.14±0.25花青素組（25 μg/ml）0.78±0.19＊ 0.79±0.32＊花青素組（50 μg/ml）0.56±0.14# 0.61±0.13#花青素組（100 μg/ml）0.39±0.11# 0.45±0.16#

炎癥部位的血管內(nèi)皮細胞既是炎癥過程的參與者，也是炎癥過程的調(diào)節(jié)者［5］。長期或者反復的暴露于心血管危險因素，將會導致內(nèi)源性抗炎系統(tǒng)內(nèi)皮細胞的損傷。最終內(nèi)皮不僅喪失功能，而且也會失去其完整性，進一步的衰老而脫落至循環(huán)系統(tǒng)。因此，修復損傷的內(nèi)皮細胞，對改善血管的功能起著至關重要的作用［6］。

ROS 是指 O－2、脂多糖（LPS）等活性氧簇，大量ROS能夠促進氧化應激誘導內(nèi)皮細胞損傷及凋亡［7］。該實驗中，脂多糖（LPS）能夠誘導HUVECs產(chǎn)生過量ROS，直接影響細胞存活和功能；而花青素組能明顯降低ROS的產(chǎn)生發(fā)揮保護內(nèi)皮細胞作用。許多實驗研究和臨床研究表明，氧化應激與動脈粥樣硬化高危因素（如高血壓，高脂血癥，糖尿病，吸煙等）引起的內(nèi)皮細胞異常密切相關［8］。 LDH，MDA，SOD和GSH-PX可以反映HUVECs的抗氧化能力。氧化損傷后細胞膜的完整性可以通過LDH釋放量來反映。同時，作為脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，MDA可以反映人體氧自由基的代謝和自由基攻擊細胞的損傷程度。該實驗中，模型組LDH和MDA升高，而不同濃度的花青素組LDH和MDA含量逐漸下降。證明花青素可以維持HUVECs細胞的完整性，減少氧化損傷。SOD和GSH-PX作為抗氧化酶能夠拮抗氧化應激引起的細胞損傷，修復受損細胞，其活性可以反映機體的抗氧化能力。該實驗中，模型組SOD和GSH-PX活性下降，而花青素組HUVECs的SOD和GSH-PX活性顯著增加，說明花青素有助于恢復模型組的抗氧化能力血管內(nèi)皮細胞。該實驗中，模型組HUVECs活力明顯下降，而花青素組能明顯提升了HUVECs活力。炎癥因子IL-6，TNF-α在動脈粥樣硬化起始環(huán)節(jié)起著重要作用［1，9］，該實驗中模型組IL-6，TNF-α含量明顯上升，而花青素組明顯降低了IL-6，TNF-α含量，說明花青素具有明顯抗炎作用而發(fā)揮對內(nèi)皮細胞的保護。NO是血管內(nèi)皮細胞釋放的重要舒血管物質(zhì)，能夠直接反映內(nèi)皮細胞分泌功能的強弱［10］。該實驗中模型組NO含量明顯下降，提示內(nèi)皮細胞分泌功能減弱，而花青素組明顯增加了NO含量，提示花青素恢復了脂多糖（LPS）損傷HUVEC正常分泌功能。

綜上所述，脂多糖（LPS）可導致HUVECs損傷，而花青素對內(nèi)皮細胞具有直接保護作用，減少ROS導致的氧化應激和炎癥反應，恢復HUVECs正常分泌功能，且部分可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路發(fā)揮作用。深入研究內(nèi)皮細胞炎癥與動脈粥樣硬化病理過程的關系及其具體分子機制，將有助于理解和完善動脈粥樣硬化的發(fā)病機制，將內(nèi)皮細胞炎癥作為治療靶點，干預炎癥的信號途徑，為研發(fā)新藥物和基因治療提供理論基礎。