膿腫分枝桿菌16S rRNA檢測及生物學特性研究

孫銘艷 吳倩倩 王業鑫 王楠 劉言霞 陶元勇

261031山東，濰坊醫學院附屬醫院檢驗科（孫銘艷、吳倩倩、王楠、劉言霞、陶元勇），關節外科（王業鑫）

膿腫分枝桿菌（Mycobacterium abscessus）是一種非結核分枝桿菌［1］，生長迅速，7 d內可形成肉眼可見的菌落，主要寄生在人和動物的消化道和呼吸道內，廣泛分布于土壤、食物、水源等處［2］。該菌常引起皮膚和軟組織感染，多見于注射污染、手術傷口引起的局部感染和膿腫［3］。我們對1例患者左膝關節內側皮下軟組織膿液中分離的膿腫分枝桿菌進行生物學特性研究及16S rRNA基因檢測，探索膿腫分枝桿菌的鑒定方法。

一、臨床資料

患者女，60歲，因左膝內側皮膚紅腫熱痛1個月余，于2017年12月18日就診。患者1個月前發現左膝關節內側皮膚紅腫，局部皮溫升高，觸痛明顯，局部無皮膚破損，無發熱、咽痛等全身不適，自行用“藥酒”治療無效，紅腫范圍逐漸增大，可觸及皮下硬結。左膝關節內側核磁共振示皮下軟組織水腫，局部穿刺，抽出約10 ml膿液。患者自發病以來，精神狀態尚可，飲食及大小便正常，體重較前無明顯變化。

二、細菌培養與鑒定

1.細菌培養：將膿液標本接種于哥倫比亞血平板，35℃孵育48 h，取菌落行革蘭染色及抗酸染色鏡檢，觸酶試驗、硝酸鹽還原試驗、尿素分解試驗觀察生化反應特性。

2.藥敏試驗：采用比例法［4］，將分離菌接種于分枝桿菌藥敏羅氏培養基，根據藥敏培養基上生長菌落數與對照培養基上生長菌落數之比判定藥物敏感性，如果耐藥百分比大于1%報告耐藥，否則報告敏感。

3.基質輔助激光解吸電離飛行時間（MALDI-TOF）質譜鑒定：用定量接種環取1 μl菌，加入到含直徑0.5 mm玻璃珠的1.5 ml離心管，加入70%乙醇500 μl，渦旋振蕩混勻并將全部液體轉移到2 ml圓底無色離心管中，10 000×g離心2 min，棄上清液，先后加入70%甲酸、乙腈各10 μl，渦旋振蕩。取1 μl標本涂于靶板，加入1 μl CHCA（α-氰基-4-羥基肉桂酸+乙腈）基質液，待完全干燥后，使用MALDI-TOF質譜儀（法國梅里埃公司）鑒定，將所得質譜圖與標準數據庫中的質譜圖進行匹配。

4.16 S rRNA基因檢測：取哥倫比亞血平板上的菌落接種于肉湯培養基中，孵育過夜，將1 ml菌液加入到1.5 ml離心管中，4 250×g離心1 min，棄上清液，收集菌體，按Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒說明書提取基因組DNA。基因組DNA PCR擴增16S rRNA基因，按試劑盒說明操作，正向引物 5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，反向引物5′-GGTT ACCTTGTTACGACTT-3′。PCR產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，使用自動凝膠成像系統分析。從PCR產物電泳條帶上切割所需DNA目的條帶，使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒純化回收后測序。試劑盒、引物及測序服務均由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。測序后與GenBank數據庫中已知膿腫分枝桿菌的16S rRNA基因比對。

三、結果

1.細菌培養：培養48 h，無肉眼可見的菌落；培養96 h，可見直徑約1 mm的淡黃白色、濕潤、油滑感菌落，無溶血環（圖1）。菌落涂片革蘭染色陽性（圖2），抗酸染色陽性（圖3），觸酶試驗陽性，硝酸鹽還原試驗陰性，尿素分解試驗陰性。

圖1 膿液標本培養96 h，可見直徑約1 mm淡黃白色、濕潤、油滑感菌落，無溶血環

圖2 菌落涂片革蘭染色陽性

圖3 菌落涂片抗酸染色陽性

2.藥敏試驗：該菌對阿米卡星、莫西沙星、左氧氟沙星敏感，對鏈霉素、異煙肼、利福平、乙胺丁醇、氧氟沙星、卡那霉素、卷曲霉素、對氨基水楊酸、丙硫異煙胺、利福布汀耐藥。

3.鑒定：分離菌株的MALDI-TOF質譜圖與數據庫中已有的膿腫分枝桿菌質譜圖比較，吻合度最高，鑒定為膿腫分枝桿菌，置信度為99.9%（圖4）。菌落的基因組DNA PCR產物約為1 380 bp（圖5），測序后與已知膿腫分枝桿菌的16S rRNA基因相似性為99%，用MEGA7軟件構建分離菌的系統進化樹，可見分離菌與膿腫分枝桿菌位于同一分支（圖6），鑒定為膿腫分枝桿菌，登錄號為NR 074427.1。

圖4 膿腫分枝桿菌質譜圖 分離菌株與數據庫中已有的膿腫分枝桿菌質譜圖吻合度最高，鑒定為膿腫分枝桿菌

圖5 膿腫分枝桿菌臨床分離株16S rRNA基因擴增產物瓊脂糖凝膠電泳 基因組DNA PCR產物長度約為1 380 bp。M：DNA標準參照物；1：產物DNA

圖6 膿腫分枝桿菌臨床分離菌株的系統進化樹 分離菌與膿腫分枝桿菌位于同一分支，鑒定為膿腫分枝桿菌

4.診斷：左膝關節皮下軟組織感染。

5.治療：根據藥敏試驗結果，給予靜脈滴注阿米卡星0.2 g/d、左氧氟沙星0.3 g/12 h，并實施左膝膿腫引流術，治療13 d后，患處無明顯滲出物，腫脹消退，應患者要求出院。出院后3個月隨訪，患處無明顯滲出物，無紅腫，癥狀好轉。

四、討論

膿腫分枝桿菌常引起皮膚感染，人和動物均可致病，早期可表現為紅腫、硬塊，晚期表現為局限性及多發性膿腫［5-6］。本分離菌來自患者的皮下膿腫，革蘭染色、抗酸染色均陽性，菌落有油滑感，初步判斷為非結核分枝桿菌。目前細菌鑒定方法大多采用生化反應及血清學檢測等，存在時間長、準確性差等缺點，全自動細菌鑒定分析儀也只能鑒定有限的細菌。近來，分子生物學方法廣泛應用于細菌菌種的鑒定，具有快速、準確等優點［7］。細菌的rRNA包括5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA，其中16S rRNA具有含量多、分子量適中、高度保守等特點，所以，16S rRNA基因測序常用于細菌鑒定［8-9］。

近年來，MALDI-TOF MS廣泛應用于臨床實驗室細菌及真菌鑒定［10-11］，其對革蘭陽性球菌、腸桿菌科細菌、非發酵菌等臨床常見細菌的鑒定準確率均大于96%，對非結核分枝桿菌的鑒定準確率為94.60%［12］。本研究使用MALDI-TOF MS檢測分離株，得到的質譜圖與數據庫中已有的膿腫分枝桿菌質譜圖比較，吻合度最高，置信度為99.9%。同時也通過擴增分離菌株的16S rRNA與GenBank數據庫中的序列進行同源性比較顯示，與已知膿腫分枝桿菌的相似性為99%，由分離株的系統進化樹可知，該分離菌與Mycobacterium abscessus位于同一分支，鑒定為膿腫分枝桿菌，登錄號為NR 074427.1。

綜上所述，本文患者分離菌株經MALDI-TOF MS與16S rRNA基因檢測，鑒定為膿腫分枝桿菌，是導致患者左膝關節內側皮膚膿腫的主要致病菌，根據藥敏試驗結果給予相應治療后，患者病情好轉。