抑癌基因DKK3過表達抑制人皮膚黑素瘤細胞遷移和侵襲的機制探討

李晶 余音 陳靜 張欣 劉冬陽 黎智 刁慶春 劉素桃 金晶 王燦

400011重慶市中醫院皮膚科（李晶、余音、劉冬陽、黎智、刁慶春、劉素桃）；重慶大學附屬腫瘤醫院 重慶市腫瘤研究所 重慶市腫瘤醫院放療科（陳靜、張欣、王燦）；湖北省荊門市第二人民醫院手術室（金晶）

實驗發現［1］，DKK3（dickkopf-related protein 3）作為抑癌基因通過阻滯細胞周期和誘導凋亡以及影響細胞周期和凋亡的相關蛋白表達抑制人惡性黑素瘤（簡稱惡黑）的進程，而DKK3在轉移性惡黑中的表達及與臨床特征的關系尚不清楚，DKK3能否作為功能性抑癌基因抑制惡黑細胞遷移和侵襲尚不清楚。本研究通過驗證DKK3對人皮膚惡黑細胞遷移和侵襲的作用及機制，探討皮膚惡黑的轉移相關分子機制。

對象與方法

1.對象：2014年8月至2017年6月在重慶市中醫院皮膚科收集58例黑素瘤患者（包括48例原發性黑素瘤和10例轉移性黑素瘤）和30例色素痣患者。黑素瘤患者中，男35例（60.3%），女23例（39.7%），34例（58.6%）年齡 ＞50歲；36例（62.1%）病變位于頭和軀干，22例（37.9%）位于四肢；肢端雀斑樣型29例，淺表擴散型5例，結節型9例，黏膜型15例；病理分期，TNMⅠ+Ⅱ期36例（62.1%）、Ⅲ期22例（37.9%）。色素痣患者中，男21例（70%），女9例（30%），19例（63.3%）年齡＞50歲。黑素瘤患者與色素痣患者性別和年齡分布差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究通過重慶市中醫院醫學倫理委員會批準（CQZYY20160109），患者均簽署知情同意書。所有皮膚惡黑和色素痣均經重慶市中醫院病理科確診。

2.試劑和儀器：本研究使用的RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、黑素瘤細胞系等均同前期研究［1］。侵襲相關蛋白：上皮鈣黏著蛋白（E-cad）、神經鈣黏著蛋白（N-cad）、波形蛋白、基質金屬蛋白酶2（MMP2）、MMP7、MMP11的一抗、二抗抗體均為美國Abcam公司產品（一抗為鼠抗人單克隆或多克隆抗體，二抗為山羊抗鼠IgG，內參為β肌動蛋白）。

3.實驗方案：先通過Western印跡法檢測DDK3蛋白在7株人黑素瘤細胞系和色素痣組織中的表達，再通過實時熒光定量PCR（qPCR）檢測DDK3 mRNA在色素痣、原發性黑素瘤、轉移性黑素瘤組織中的表達。然后構建DKK3過表達質粒［pcDNA3.1（+）-Flag-DDK3］轉染A375細胞，取成功轉染DKK3基因的A375細胞（轉染組）與對照組細胞（轉染空質粒）進行細胞劃痕實驗、細胞遷移及侵襲實驗，Western印跡法檢測遷移與侵襲相關蛋白（E-cad、N-cad、波形蛋白、MMP2、MMP7、MMP11）的表達，qPCR 檢測相關基因 mRNA 的表達（2-ΔΔCt法）。mRNA、蛋白的提取與檢測方法同文獻［1］。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列見表1。

表1 DKK3及黑素瘤遷移與侵襲相關基因引物

4.細胞劃痕實驗：收集轉染組與對照組A375細胞，分別種于無菌6孔板中（約1×105/孔），細胞孵育箱中培養18～20 h，細胞融合度80%～90%時，以無菌小槍頭在6孔板底部輕微垂直劃線，磷酸鹽緩沖液洗去脫落的細胞，以無血清1640培養液繼續培養，分別培養開始和18 h后在倒置顯微鏡下拍照，計算劃痕遷移率，評估細胞愈合能力，劃痕遷移率越大細胞愈合能力越強。劃痕遷移率=（原始寬度-18 h寬度）/原始寬度×100%。

5.細胞遷移實驗：收集轉染組與對照組A375細胞，倒置顯微鏡下計數并按5×103細胞/孔接種于Transwell小室上室，下室加入約700 μl 1640培養液（15%），細胞孵育箱中繼續培養20 h后取出下室，固定、染色，顯微鏡下隨機取5個視野計算穿出小室細胞數，細胞數量越多遷移能力越強。

6.細胞侵襲實驗：實驗前在Transwell小室上室鋪稀釋后的無血清基質膠（無血清1640培養液與基質膠配比為1∶4），并放于細胞孵育箱中，待充分凝固后進行侵襲實驗，方法同上述遷移實驗。

7.統計處理：采用SPSS 13.0軟件，計量資料以±sx表示。兩獨立樣本的比較采用t檢驗；多組數據的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.DKK3蛋白在人黑素瘤細胞系中的表達：DKK3蛋白在 HM、A375、WM451、SK-MEL-1、Hs-695T細胞系中表達缺失，在MDA-MB-435s、WM35細胞系中表達低于正常色素痣細胞。見圖1。

圖1 DKK3在人黑素瘤細胞系中的表達 DKK3蛋白在人黑素瘤細胞系中表達缺失或低表達，在色素痣細胞中高表達。1：HM；2：A375；3：WM451；4：SK-MEL-1；5：Hs-695T；6：MDA-MB-435s；7：WM35；8、9：色素痣

2.DKK3 mRNA在人皮膚惡黑組織中的表達：DKK3 mRNA在原發性黑素瘤、轉移性黑素瘤與色素痣中表達水平差異有統計學意義（F=46.57，P＜0.05），轉移性黑素瘤DKK3 mRNA表達水平低于原發性黑素瘤和色素痣，LSD-t分別為2.48、3.12，均P＜0.05。見圖2。

圖2 DKK3 mRNA在人皮膚黑素瘤及色素痣組織中的表達兩兩組間比較，均P＜0.001

3.轉染DKK3后黑素瘤細胞遷移和侵襲能力：見圖3、4。轉染組A375細胞培養18 h后劃痕遷移率（22.11%±5.11%）低于對照組（54.36%±23.22%），t=2.36，P＜0.001。遷移實驗中轉染組穿出小室細胞數（265±33）低于對照組（429±41），侵襲試驗中轉染組穿出小室細胞（76±18）亦低于對照組（135±21），差異均有統計學意義（t值分別為1.24、1.35，均P＜ 0.001）。

圖3 轉染DKK3對黑素瘤細胞A375劃痕實驗的影響 轉染后18 h，轉染組細胞的劃痕遷移率低于對照組

圖4 DKK3過表達對黑素瘤細胞A375遷移和侵襲的影響 轉染組A375細胞遷移與侵襲細胞數少于對照組

4.黑素瘤細胞中遷移和侵襲相關蛋白和mRNA的表達：與對照組相比，轉染組A375細胞波形蛋白、N-cad、MMP7、MMP2和MMP11蛋白和mRNA表達水平均降低，E-cad蛋白和mRNA表達水平增高（均P＜0.001）。見圖5。

圖5 DKK3過表達對黑素瘤細胞A375遷移和侵襲相關蛋白表達的影響 5A：Western印跡法檢測上皮鈣黏著蛋白（E-cad）、神經鈣黏著蛋白N（N-cad）、波形蛋白、基質金屬蛋白酶2（MMP2）、MMP7、MMP11的表達；5B：實時熒光定量PCR檢測A375細胞遷移和侵襲相關mRNA的表達，以轉染組mRNA表達水平為1，兩組間各基因mRNA表達差異均有統計學意義（P＜0.001）

討 論

腫瘤侵襲轉移是多因素、多步驟參與的復雜過程，皮膚惡黑的侵襲轉移和其他惡性腫瘤相似，是一個連續性、動態化的生物學過程［2-3］。腫瘤細胞首先從原發病灶脫落，侵入到細胞外基質，與細胞間質中一些分子黏附，并激活細胞合成、分泌各種降解酶類，協助腫瘤細胞穿過基底膜進入血管、淋巴管，然后在某些因子的作用下運行并穿過血管壁外滲到相應組織滯留，繼續增殖，形成轉移灶。在前期研究中我們發現，DKK3作為抑癌基因抑制惡黑細胞增殖和促進細胞凋亡［1］。DKK3能否作為預測皮膚惡黑轉移的分子標志物尚不清楚。因此，本實驗中我們主要關注DKK3對皮膚惡黑細胞遷移和侵襲的影響及相關分子機制。

我們通過Western印跡實驗發現，DKK3蛋白在黑素瘤細胞系中呈低表達或缺失，而在正常的色素痣細胞中高表達，這與前期DKK3 mRNA檢測結果［1］一致。qPCR檢測顯示，惡黑中DKK3 mRNA表達下調，轉移性皮膚惡黑中DKK3 mRNA的表達低于非轉移性皮膚惡黑，提示DKK3可能參與皮膚惡黑的轉移。與國外文獻報道一致［4］。本實驗中，A375細胞轉染 pcDNA3.1（+）-Flag-DKK3 質粒后，細胞劃痕愈合能力顯著低于對照組，同時Transwell遷移和侵襲實驗顯示，轉染后A375細胞的遷移和侵襲能力均明顯被抑制。

為進一步探討DKK3抑制皮膚惡黑細胞遷移和侵襲的分子機制，本研究采用qPCR和Western印跡法分析遷移和侵襲相關mRNA和蛋白的表達。結果顯示，過表達DKK3后波形蛋白、N-cad、MMP2、MMP7、MMP11表達顯著下降，但E-cad表達上升。E-cad表達缺失是上皮間質轉化（epithelial-tomesenchymal transition，EMT）的關鍵步驟，而EMT是腫瘤細胞遠處轉移必經步驟之一，EMT相關信號通路的激活及相互作用介導了腫瘤的侵襲轉移、存活以及生長過程［5-7］。最近研究顯示發生EMT的細胞可以獲得類似于干細胞的特性，這些尚未分化的間質細胞從表達E-cad變為表達N-cad，并且抑制波形蛋白表達，促進一些細胞全能性轉錄因子如Oct-4和Nanog的表達［7-8］。本研究結果提示，過表達DKK3能夠抑制惡黑EMT的變化。MMP表達與癌細胞去分化和侵襲性行為有關，通常提示患者預后不良［9］。本研究結果顯示，DKK3可能是潛在的抑癌基因，通過抑制EMT抑制皮膚惡黑的轉移。

綜上所述，DKK3在人皮膚惡黑細胞和組織中表達下調，過表達DKK3能通過調節EMT抑制黑素瘤細胞的遷移和侵襲，可能成為轉移性皮膚惡黑的診療靶點。