中風病急性期痰熱證與MMP-1和MMP-3表達的影響＊

郭春莉，付 強，高 穎

（1. 中國中醫科學院西苑醫院 北京 100091；2. 中國標準化研究院 北京 100191；3. 北京中醫藥大學東直門醫院 北京 100700）

中風病是嚴重危害人類健康的常見病，具有高發病率、高致殘率、高死亡率和高復發率的特點，已成為第一位致殘和死亡的原因[1]。雖然超早期溶栓和急性期神經元保護取得了重要進展，但對于大多數腦缺血患者而言，神經元死亡不可避免[2]，患者多需要他人幫助才能完成日常生活活動，給社會和家庭帶來沉重負擔。基質金屬蛋白酶（MMPs）是降解細胞外基質的蛋白酶類之一，在大腦的血管內皮細胞、星形細胞和小膠質細胞中都存在許多種類的MMPs，在出現腦缺血或者缺血的灌注損傷時，MMPs 被激活開始破壞基質和開放血腦屏障，導致腦水腫，促進急性腦梗死發病[3]。基質金屬蛋白酶家族在人的動脈斑塊損傷部位表達。激活的MMPs 降解纖維帽的結構基質組成，包括膠原纖維和彈力纖維，削弱纖維帽，成為斑塊不穩定的主要因素。在外在觸發條件下，斑塊破裂，釋放大量組織因子、激活血小板和凝血系統，形成血栓，導致腦血管疾病[4]。MMP-1是基質金屬蛋白酶家族中表達量最高的間質膠原酶，動脈粥樣硬化斑塊脂質核心強烈表達MMP-1，局部血壓增高，血流剪切力增強，可使血管壁合成MMP-1 增加，所以MMP-1 的表達與斑塊破裂存在正相關，MMP-1 含量越高之處，斑塊越易破裂[5]。Carrell 把動脈硬化損傷分成兩類:①血管壁膠原數量增加致使血管腔變窄；②動脈瘤的出現使管腔體積變小，管腔發生破裂。目前研究表明，兩種管壁損傷中都出現了MMP-1水平增高[6]，表明MMP-1 可能和動脈粥樣硬化過程存在重要的關系。MMP-3 也是在動脈粥樣斑塊中表達的MMPs 家族的主要成員，它廣泛存在于動脈粥樣病變處，在斑塊破裂中起重要作用，如果頸動脈B 超發現軟斑塊結合臨床血漿MMP-3 升高，可進一步反應斑塊的不穩定性，要積極地抗炎治療，以預防及控制動脈粥樣硬化的發生、發展，并預防和控制TIA進一步發展為腦梗死[7]。Henney等運用原位雜交技術檢測到冠狀動脈粥樣硬化斑塊中MMP-3 的轉錄物與巨噬細胞共同存在于斑塊的肩部[8]。Silence Y 等[9]的研究也證實MMP-3 可通過降解基質成分而與斑塊的不穩定性有關，從而認為，MMP-3 血清水平與頸動脈斑塊穩定性有關，可能是反映動脈粥樣硬化斑塊不穩定性的新的指標。臨床證據表明，中藥對缺血性卒中治療有效，其主要是通過干預證候達到改善或治療疾病，臨床研究提示，中風急性期約有40%-50%的病人表現出痰熱證，中醫藥對中風病急性期痰熱證的治療也突顯優勢，之前的研究顯示MMP-2 與中風病急性期痰熱證存在相關性，可以成為微觀辨證的依據，MMP-1 和MMP-3 亞型與腦梗塞的分型目前有一些相關性研究，MMP-1 和MMP-3與中風病急性期痰熱證是否存在相關性，其相關性研究能否形成微觀辨證的依據，以及能否成為證候診斷及療效評價的依據對中醫藥治療中風病具有重要的意義，目前未發現相關報道。

1 研究資料和方法

1.1 臨床資料

本研究數據來源于2013 年8 月-2015 年5 月發病7 天內就診于中國中醫科學院西苑醫院的缺血性中風痰熱證患者45 名，非痰熱證44 名，發病年齡均為35-85歲。

1.2 篩選中風病急性期受試者

1.2.1 疾病診斷

疾病診斷標準參照2005年衛生部疾病控制司、中華醫學會神經病學分會頒布的《中國腦血管病防治指南（試行版）》的腦梗塞診斷部分。

1.2.2 證候診斷

證候診斷標準參照973 計劃“缺血性中風病證結合的診斷標準與療效評價體系研究”課題組制定的《缺血性中風證候要素診斷量表》。

1.2.3 納入標準

符合疾病診斷標準；起病7 天以內；年齡≥35 歲且≤85歲者。

1.2.4 排除標準

蛛網膜下腔出血者；既往有腫瘤、造血系統疾病者；有精神性疾病患者；不配合者。

1.3 臨床信息采集

所有入選受試者均填寫統一表格，表格內容主要是人口學資料、病史調查，中風病急性期受試者并填寫病例觀察表、中風病證候要素診斷量表，分為痰熱組和非痰熱組，均于入院后第1 d 清晨空腹取血，采用酶聯免疫吸附法測定血清MMP1和MMP-3水平。

1.4 研究方法

1.4.1 證候量化評定

經過統一組織的量表使用培訓后，由納入之日由腦病科醫師使用《缺血性中風證候要素診斷量表》，對每例患者分別作出內風證、內火證、痰濕證、血瘀證、氣虛證和陰虛證的量化診斷（得分≥10分診斷成立）。

1.4.2 受試者血清MMP1和MMP3的測定

在缺血性中風病起病第7 d 采肘靜脈血10 mL，留取標本后盡快注入EDTA 抗凝管內，4℃、3000 r·min-1離心10 min，吸取上清液，-20℃至-80℃保存待測。采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法檢測血清中MMP1 和MMP-3的含量（ng·mL-1）。

1.5 實施過程及結果

1.5.1 試驗儀器

酶標儀：芬蘭（LabsystemsMultiskan MS），儀器型號：352 型；洗板機：（芬蘭）Thermo Labsystems，儀器型號：AC8；離心機：微量高速離心機（國產），儀器型號：TG16W；培養箱：隔水式恒溫培養箱（國產），儀器型號：GNP-9080型。

1.5.2 操作步驟

標準品的稀釋與加樣：標準品按照說明書稀釋好五個梯度，各個梯度每孔加樣量都為50 μl，

加樣：分別設空白孔、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μl，然后再加待測樣品10 μl。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 min。

配液洗滌：將30（48T 的20 倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T 的20 倍）倍稀釋后備用；小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒后棄去，如此重復5次，拍干。

加酶：每孔加入酶標試劑50 μl，空白孔除外。

溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 min。

洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復5次，拍干。

顯色：每孔先加入顯色劑A50 μl，再加入顯色劑B50 μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 min.

終止：每孔加終止液50 μl，終止反應

測定：以空白空調零，450 nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。測定應在加終止液后15 min 以內進行。（主波長450，輔助波長630）

1.5.3 計算

以標準物的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD 值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD 值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

1.6 統計學方法

應用SPSS 17.0版本，組內數據分析采取獨立樣本t檢驗，組間分析采取單向方差分析的方法.

表1 痰熱組和非痰熱組MMP1（ng·mL-1）含量測定參數

表2 痰熱組和非痰熱組MMP3（ng·mL-1）含量測定參數

2 研究結果

研究結果如下圖所示：

研究共納入缺血性中風患者89名，研究人員經過統一組織的量表使用培訓后，由腦病科醫師使用《缺血性中風證候要素診斷量表》，對每例患者分別作出內風證、內火證、痰濕證、血瘀證、氣虛證和陰虛證的量化診斷（得分≥10 分診斷成立）。痰熱證患者45名，非痰熱證44名，所有入選受試者均填寫統一表格，表格內容主要是人口學資料（指調查患者的個人信息，包括患者姓名、性別、出生日期、家庭住址、聯系電話等）、病史調查（既往史、家族史、過敏史、生命體征、一般內科情況、神經系統檢查等），中風病急性期受試者并填寫病例觀察表、中風病證候要素診斷量表。結果顯示，發病7天內中風病痰熱組MMP-1和MMP-3的表達較非痰熱組比較，P＞0.05，統計學無明顯差異。

3 討論

中藥對缺血性卒中治療有效，其主要是通過干預證候達到改善或治療疾病，因此證候的規范化研究一直是中風病診療研究的重點和難點。

“辨證論治”被認為是中醫學術思想的精髓，已經成為指導中醫臨床診斷和治療的基礎。“辨證”就是對病人四診所收集的臨床信息進行概括、判斷為某種證候，是論治的前提和依據，“論治”是根據辨的證候來確定治法和處方譴藥，因此“證候”是連接中醫學理論和臨床研究的核心與關鍵問題。傳統中醫只能依靠望、聞、問、切來獲取患者的臨床信息等病情資料，臨床信息分辨率低、信息量小，模糊性大，信息收集過程中主觀性很大，而且受到個人師承、臨床經驗、認知水平和方法及不同時代的不同，導致辨出的證候差別很大，使得辨證的精確性和重復性較差，影響了研究結論的真實性和可靠性，而且證候的概念模糊不清，表現出對證候名稱及其內涵描述的經驗化和隨意性。所以，目前的中醫證候描述存在不確定性、中醫病名描述缺乏規范性，隨意性較大，缺乏統一的標準，不利于中醫、西醫理論的滲透和溝通，不利于自身的學術交流與對外交流，急需對證候規范化提出新的要求。

宏觀辨證是指以中醫基礎理論為指導，根據四診所取得的信息，判斷出因、位、病、勢的辨證方法。微觀辨證是運用現代科技方法對中醫證候內在的病理、生化等方面的客觀指標進行分析，目的是深入探討證候的內在機理，揭示其發生的物質基礎，從而用客觀指標補充中醫病證診斷標準。宏觀辨證客觀化，微觀指標整體化，宏觀辨證與微觀辨證有機地結合有利于證候診斷與評價的客觀化，有利于中西醫結合工作的推動。

王永炎院士對于證候的生物學基礎研究方面，提出了重要的“證候概念及其屬性”理論[10]：即證候是一個非線性的“內實外虛”、“動態時空”和“多維界面”的復雜系統，所謂“實”是指最能反映證候病機的權重最大的關鍵內容，是群體在某一特定病變過程中所具有的共性癥狀信息，是治則干預的依據。“虛”是指某一患者所表現的一系列個性化癥狀信息，對干預原則和方法具有一定影響作用。其中“內實外虛”是證候最重要的特性，這對于證候的基礎研究有著重要的指導意義。基于證候概念的新詮釋，生物學指標與中醫證候是否相關，或者說中醫證候微觀指標的研究成為了難點、熱點。證候與生物學指標的相關性研究也取得了豐碩成果，主要表現在以下方面：①篩查某一證候可能發生變化的指標；②某一疾病的西醫診斷指標和其中醫證型之間相關性的研究；③不同疾病同一證候微觀指標異同的研究；④證候主要癥狀特征的現代醫學闡釋[11]。例如近些年對血瘀證的研究報道較多，在實驗研究中發現了許多與血瘀證相關的指標，并將微循環障礙、血流變異常、血液凝固性增高或纖溶活性降低等6 項指標補充到了血瘀證的診斷標準中[12]。危氏等[13]通過對多種疾病的證候與實驗室指標相關性的分析，臨床觀察了慢性胃炎和潰瘍病患者102例，脾胃虛弱證組與脾胃濕熱證相比，脾胃濕熱證的幽門彎曲桿菌陽性率明顯高于脾胃虛弱證，說明幽門彎曲桿菌感染與中醫證候有一定相關性。

以高穎教授牽頭的國家科技重大專項“重大新藥創制”課題組（No.2009ZX09502-028），國家重點基礎研究發展計劃（973 計劃）課題組（No.2003CB517102）既往動態采集175 例急性缺血性中風病患者四診信息，并判斷其證候要素，應用數據挖掘手段探討缺血性中風急性期證候與生物學指標的關系，發現HSP70、ICAM-1、MMP9 可能是缺血性中風急性期血瘀證的微觀指標，HSP70 可能為氣虛證的微觀指標。以上研究結果均為本課題的實施提供研究基礎。

臨床研究提示，中風急性期約有40%-50%的病人表現出痰熱證，痰為氣血津液代謝紊亂的產物，為有形之邪，具有黏稠重濁之性，易與火熱相結，二者交結難解，不易變化。便秘便干、舌苔黃膩、脈弦滑構成中風病急性期痰熱證的基本證候特征及辨證要點[14]。王永炎院士指出中風病急性期病機錯綜復雜，證候變化多端，病勢發展迅猛，難以駕馭，且變證壞證頻見，極易產生神昏、竅閉、厥脫等，為難治重證，提出了“毒損腦絡”中風病機理論的觀點。中醫藥對中風病急性期痰熱證的治療也突顯優勢。

大量臨床實踐證明痰熱證是中風病急性期的常見證候，痰熱證的證候演變特點及其與神經功能缺損程度密切相關，中醫藥主要是通過干預中風病痰熱證證候因素以改善癥狀或治療疾病。本研究結合前期研究的基礎上，以王永炎院士提出的“證候概念及其屬性”理論為依據，以痰熱證與基質金屬蛋白酶相關亞型的關系為切入點，發現中風病急性期痰熱證的MMP-1 和MMP-3 的表達較非痰熱組無明顯差異，其原因解釋為：①雖然此次試驗的結果為陰性，但是可能因受試者基礎疾病比較復雜，比如高血壓、糖尿病、高脂血癥、高同型半胱氨酸血癥以及吸煙、飲酒等生活習慣均可能影響MMP1、和MMP3，可以通過擴大樣本量，避免其它諸多因素對試驗結果的干擾，來發現更為可靠的試驗結果；②雖然本次研究顯示中風病急性期痰熱證與MMP1、MMP3 無明顯相關性，試驗結果為陰性，但中風病急性期的痰熱證預后差，病情兇險確實與基質金屬蛋白酶的某些亞型可能存在相關性，今后的試驗可以通過多檢測基質金屬蛋白酶亞型來確定中風病急性期與基質金屬蛋白酶表達的相關性，進一步對中風病痰熱證證候診斷及療效評價提供更加客觀支持。