基于高效液相色譜法指紋圖譜技術的不同產地、不同生長方式喜馬拉雅紫茉莉品質分析＊

邵遠洋，彭 蓮，俞越童，曹光昭，鄒慧琴＊＊，閆永紅＊＊

（1. 北京中醫藥大學中藥學院 北京 100102；2. 中山大學附屬第三醫院 廣州 510630）

喜馬拉雅紫茉莉（Mirabilis himalaica(Edgew.)Heim.）始載于藏醫藥學《月王藥診》，分布于我國西藏、甘肅和青海等地區；《中國植物志》描述喜馬拉雅紫茉莉屬于山紫茉莉，為1年或多年生草本；其入藥部位是干燥的根，有溫胃、暖腎、生肌、排石、利尿等功效，可用于治療腰、下腹、關節痛及下半身寒等癥[1]；藏醫記載，喜馬拉雅紫茉莉是藏藥五根藥的上品[2,3]，其在藏醫藥的應用中歷史悠久。

高效液相色譜技術具有靈敏度高、效率高等優點，主要應用于大多數的非揮發、熱不穩定的化合物的研究，在民族藥的研究中是應用最廣泛的技術之一[4,5]。中藥指紋圖譜：中藥材經適當處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標示該中藥材特性的共有峰的圖譜[6]。HPLC 指紋圖譜可以實現中藥材的定性、定量評價，協助完成藥材的產地、物種的判別[7,8]。胡春月等運用HPLC 指紋圖譜技術對禹州漏蘆正丁醇部位進行研究，為禹州漏蘆保肝活性的研究及臨床應用提供一定的參考[9]；李嫻等對熟地黃制炭前后的化學成分進行HPLC 指紋圖譜的研究[10]；鄭孟凱等運用HPLC 指紋圖譜技術客觀、有效的評價了不同產區的市售麻黃的質量[11]；楊秀娟等運用HPLC 指紋圖譜技術研究甘肅不同產區的紅芪[12]，為甘肅產區紅芪的質量評價及產地鑒別提供了有價值的參考；寧德生等[13]運用HPLC 指紋圖譜對地楓皮進行相關研究，完善了地楓皮真偽的鑒別及質量的控制標準；閆偉偉等[14]運用HPLC 指紋圖譜技術對不同產地的杏花進行質量評價，發現不同產地的杏花質量存在差異。HPLC 指紋圖譜技術在研究中藥化學成分中具有整體性和唯一性的特征，在中藥種類、產地以及真偽的鑒別過程中廣泛應用，隨著現代分析手段的不斷發展，HPLC 指紋圖譜技術將在中藥品質評價以及質量標準完善方面發揮重要作用。

喜馬拉雅紫茉莉主要分布于我國西藏、甘肅和青海等地區，隨著人們對喜馬拉雅紫茉莉的不斷采挖，其野生資源日趨枯竭。2006 年，旦智草等[15]首次完成了對喜馬拉雅紫茉莉人工馴化栽培試驗。近年來，關于喜馬拉雅紫茉莉的栽培技術逐步成熟，但是關于不同產區及不同生長方式的喜馬拉雅紫茉莉的質量的研究少見報道，評價其質量的實踐工作中更是無標準可依。中藥指紋圖譜在闡釋中藥復雜成分與其質量關系的過程中扮演著重要的角色，在闡釋過程中，相似度評價發揮著關鍵性的作用。本研究運用HPLC 指紋圖譜技術并結合相似度評價、主成分分析等手段，對不同產區、不同生長方式喜馬拉雅紫茉莉的質量進行研究，為全面系統的分析喜馬拉雅紫茉莉的品質提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器

島津液相LC-20A（島津企業管理（中國）有限公司），四元泵，DAD 檢測器，自動進樣器；ZORBAX Extend-C18 色譜柱（4.6 × 250 mm，5 μm）；0.45 μm 針筒式微孔濾膜過濾器；BP 211D 型電子天平（十萬分之一，德國賽多利斯）；KQ-500DE 型數控超聲波清洗器（500 W，40 KHz，昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

收集甘肅、西藏、拉薩不同產區的喜馬拉雅紫茉莉，經北京中醫藥大學閆永紅教授鑒定為喜馬拉雅紫茉莉（Mirabilis himalaica(Edgew.) Heim.）干燥根（表1）。色譜純乙腈、分析純甲醇、Mirabijalone A、Boeravinone C、 Mirabijalone I、 Mirabijalone H、Abronione 和Boeravinone F均為實驗室自制。

表1 不同產區、不同生長方式的喜馬拉雅紫茉莉樣品信息表

2 方法與結果

2.1 供試液提取溶劑的選擇

提取溶劑在一定程度上影響著有效成分峰的數目、峰形的好壞以及基線是否平穩。同一條件下，平行精密稱取同一批次喜馬拉雅紫茉莉根干燥粉末0.500 g 置于50 mL三角瓶中，依次加入10 mL甲醇、乙醇和乙酸乙酯，同樣條件下，超聲提取40 min，靜置至室溫，過濾并補足溶劑至10 mL，混勻后，0.45 μm 有機濾膜過濾1 mL 至液相小瓶，獲取續濾液，進行HPLC檢測。結果表明，選擇甲醇作為提取溶劑時，有效成分峰數目多、峰形好且基線平穩，因此本研究選擇甲醇作為提取溶劑（圖1a）。

2.2 洗脫條件的選擇

洗脫條件在成分峰分離、拖尾、重疊及基線平穩方面發揮著重要的作用。本研究選取乙腈（B），水（A）為流動相，其余條件均保持一致，在系統1、2、3、4條件下進行梯度洗脫。系統1：（0-20 min，5%-30%B；20-40 min，30%-80%B；40-50 min，80-95%B）系統2：（0-5 min，5%-5%B；5-15 min，5%-20%B；15-40 min，20%-95%B）系統3：（0-10 min，5%-30%B；10-40 min，30%-80%B；40-42 min，80%-95%B）系 統4：（0-10 min，5%-20%B；10-40 min，20%-80%B；40-42 min，80%-95%B）。結果顯示，系統4 條件下，喜馬拉雅紫茉莉有效成分間分離良好，沒有出現拖尾及重疊現象，并且基線平穩。故選擇系統4 作為洗脫條件（圖1b）。

2.3 檢測波長的選擇

檢測波長在一定程度上影響有效成分峰數目的多少、分離效果的好壞及基線是否平穩。保持其他條件相同，選擇在200-400 nm范圍內對喜馬拉雅紫茉莉特征化學成分進行掃描。波長為280 nm 時，化學成分出峰數目多，分離效果明顯，基線平穩，因此選擇280 nm作為喜馬拉雅紫茉莉HPLC 指紋圖譜的檢測波長（圖1c）。

圖1 HPLC指紋圖譜

2.4 進樣量的選擇

進樣量的多少往往會對精密度、準確度、有效成分峰數目、基線波動情況、拖尾及重疊產生影響。保持其余因素不變，控制進樣量15 μL、20 μL、25 μL，篩選最佳進樣量。進樣量為20 μL 時，精確度、準確度高、有效成分峰數目多、基線較平穩、拖尾及重疊少（圖1d）。因此選擇20 μL 作為喜馬拉雅紫茉莉HPLC指紋圖譜的進樣量。

2.5 柱溫的選擇

峰形的好壞、基線是否平穩在一定程度上取決柱溫的高低，本研究選取20℃、25℃、30℃的柱溫，其余條件保持一致，篩選最適柱溫。結果顯示，柱溫為25℃時，各個成分峰形最好，基線最平穩（圖1e）。因此選擇25℃作為喜馬拉雅紫茉莉HPLC指紋圖譜的柱溫。

2.6 方法組學考察

2.6.1 精密度試驗

精確稱取B 樣品0.500 g，按照篩選的最適條件制備供試品溶液，在同一色譜條件下，進樣20 μL，連續平行進樣6 次，記錄各個色譜峰的保留時間和峰面積以及各個峰形之間的相對標準偏差（RSD）。結果顯示，共有峰相對保留時間的RSD為0.0713%-0.2225%，相對峰面積的RSD為0.289%-1.124%，該條件下精密度良好。

2.6.2 重復性考察

精密稱取喜馬拉雅紫茉莉B 樣品，每份0.500 g，按照6.1 方法制備供試品溶液，對成分峰的峰面積及保留時間的一致性進行考察。結果表明，共有峰相對保留時間的RSD為0.199 4%-0.260 3%，相對峰面積的RSD為0.095 8%-1.3720%，該條件下重復性良好。

2.6.3 穩定性考察

精密稱取喜馬拉雅紫茉莉B 樣品0.500 g，按照同樣的方法制備樣品，在0 h，4 h，8 h，16 h，24 h，36 h 依次檢測供試品溶液。結果顯示，共有峰相對保留時間的RSD為0.074 2%-0.1350%，相對峰面積的RSD為0.0709%-1.8970%，表明樣品在36 h內穩定。

2.7 指紋圖譜建立及技術參數

2.7.1 喜馬拉雅紫茉莉指紋圖譜的建立

按照上述最適條件分析所搜集的19 批喜馬拉雅紫茉莉藥材，獲得19 批喜馬拉雅紫茉莉藥材的HPLC指紋圖譜（圖2）。將19 批喜馬拉雅紫茉莉藥材的HPLC 數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004）A 版”進行藥材對照指紋圖譜及共有模式的生成，共確定9個共有成分。

2.7.2 特征指紋峰的標定

分析19 批喜馬拉雅紫茉莉HPLC 檢測結果，依據保留時間對特征峰進行標定，結果顯示在19批喜馬拉雅紫茉莉HPLC 色譜結果中存在9 個共有峰（圖3）。核對對照品，確定4 號峰是Boeravinone C，5 號峰是Boeravinone F，6 號峰是Mirabijalone A，7 號峰是Mirabijalone I，8 號峰是 Abronione，9 號峰是Mirabijalone H，其中，9 個化合物的保留時間及峰面積（表2，表3）。

圖2 19 批喜馬拉雅紫茉莉HPLC指紋圖譜

圖3 喜馬拉雅紫茉莉對照指紋圖譜

表2 19批喜馬拉雅紫茉莉樣品共有峰保留時間

表3 19批喜馬拉雅紫茉莉樣品共有峰保留面積

2.7.3 喜馬拉雅紫茉莉指紋圖譜相似度評價

通過HPLC 指紋圖譜可獲取樣品的整體信息，分析對比圖譜，得到不同樣品間的相似度[16,17]。借助于該技術可完成對指紋圖譜全面、客觀的評價。運用國家藥典委員會2004年頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統A 版”，對19 批喜馬拉雅紫茉莉指紋圖譜相似度進行評價。結果顯示，有17個樣本的相似度在0.90 以上，該結果表明，不同產地、不同生長方式的指紋圖譜也具有非常高的相似度（表4）。

表4 19 批喜馬拉雅紫茉莉相似度計算表

2.8 喜馬拉雅紫茉莉指紋圖譜的主成分分析（PCA）

為了進一步分析不同產區、不同生長方式的喜馬拉雅紫茉莉品質差異，本研究對19批喜馬拉雅紫茉莉HPLC 指紋圖譜共有成分的相對含量進行PCA 分析（圖4）。結果顯示，在PCA圖中，19批喜馬拉雅紫茉莉的野生品和栽培品分布于圖的左右兩側。該結果表明，喜馬拉雅紫茉莉的特征性成分的差異與其生長方式存在一定的相關性。

3 討論

本研究在喜馬拉雅紫茉莉HPLC 指紋圖譜建立的過程中，對提取溶劑、洗脫條件、檢測波長、進樣量、柱溫均做了篩選，綜合特征峰的數目、形狀、特征峰之間的分離效果、基線的平穩性、準確度、精密度以及拖尾、重疊等因素，最終篩選得到提取溶劑甲醇，系統4，檢測波長280 nm，進樣量20 μL，柱溫25℃。該條件下喜馬拉雅紫茉莉中特征性成分，分離好，穩定性和重現性強。

圖4 19批喜馬拉雅紫茉莉特征性成分的PCA分析

本研究基于HPLC 指紋圖譜并結合相似度分析軟件和主成分分析方法，明確了喜馬拉雅紫茉莉指紋圖譜的特征，歸屬了HPLC 指紋圖譜中的主要指紋峰。分析表明，不同產區、不同生長方式的喜馬拉雅紫茉莉共有峰相似度較高，不同生長方式的喜馬拉雅紫茉莉特征性成分含量差異明顯。

應用HPLC 指紋圖譜能夠實現中藥較為全面、綜合的質量控制和質量評價，本研究建立了不同產地、不同生長方式的喜馬拉雅紫茉莉特征HPLC 指紋圖譜，在一定程度上彌補了喜馬拉雅紫茉莉品質評價的不足，完善了該藥的質量評價標準，為該藥的更全面、綜合的質量控制和品質評價提供重要參考。