雅連炮制工藝研究及不同炮制品中7個(gè)生物堿的含量測(cè)定＊

吳曉青，時(shí)曉媞，任瑤瑤，蔣合眾，魏 屹，譚 睿

（西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院 成都 610031）

黃連因其性味苦寒，臨床上多用其炮制品，自古以來(lái)，黃連炮制品的記載較多，炮制品種類(lèi)多達(dá)24種，最早記載可見(jiàn)于南北朝的《雷公炮炙論》。《中華人民共和國(guó)藥典》（2015 版）收載黃連片、酒黃連、姜黃連、萸黃連四種炮制品[1]。酒制能引藥上行，緩和寒性，清頭目之火；姜汁制能增強(qiáng)止嘔的作用；吳茱萸汁制能增強(qiáng)清氣分濕熱之力。《中華人民共和國(guó)藥典》（2015版）檢測(cè)小檗堿、巴馬汀、黃連堿和表小檗堿，并規(guī)定炮制輔料的用量但炮制溫度和時(shí)間等未有明確的規(guī)定，在實(shí)際操作中存在較大的主觀(guān)隨意性，導(dǎo)致炮制品質(zhì)量的參差不齊，因此，對(duì)黃連炮制工藝中關(guān)鍵操作點(diǎn)及關(guān)鍵條件進(jìn)行優(yōu)化是十分必要的。現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道中，關(guān)于黃連的炮制工藝多以味連為研究對(duì)象[2-9]，雅連為黃連中的珍品[10-11]，課題組研究表明：其總生物堿的含量與療“消渴”相關(guān)，加之雅連相對(duì)于味連質(zhì)地較疏松，因而味連的炮制工藝并不適用于雅連，因此，本研究擬以總生物堿含量作為主要指標(biāo)，對(duì)雅連的炮制工藝進(jìn)行研究，并對(duì)不同炮制品中的7 個(gè)生物堿進(jìn)行含量測(cè)定。以期形成規(guī)范的炮制工藝，建成雅連的質(zhì)量控制體系，為中藥飲片炮制規(guī)范和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定探索有益的經(jīng)驗(yàn)。

1 材料

Angilent1260-II 型高效液相色譜儀；BS-110S 電子分析天平（北京賽多利斯電子天平有限公司）；超聲波清潔器（昆山市超聲儀器有限公司）。

格陵蘭黃連堿、表小檗堿、藥根堿、黃連堿、巴馬汀購(gòu)于成都普思生物科技有限公司（批號(hào)分別為PS161130-03、PS161130-01、PS161124-01、PS161201-01、PS161130-02，含量≥98%）非洲防己堿購(gòu)于成都曼斯特生物科技有限公司（批號(hào)為MUST-14072213，含量≥98%）、鹽酸小檗堿購(gòu)于中檢院（批號(hào)為110713-200911，含量≥98%）。甲醇、乙腈（色譜純，sigma）；三乙胺、磷酸、十二烷基苯磺酸鈉、磷酸二氫鉀均為分析純。雅連購(gòu)于四川省洪雅縣瓦屋山藥業(yè)，經(jīng)西南交通大學(xué)宋良科教授鑒定為毛茛科植物三角葉黃連Coptis.deltoidea的干燥根莖。吳茱萸購(gòu)自于北京本草方源藥業(yè)有限公司（產(chǎn)地：云南），經(jīng)西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院宋良科教授鑒定為吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.。生姜經(jīng)西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院宋良科教授鑒定為姜科植物姜Zingiber officinaleRosc.的新鮮根莖。黃酒購(gòu)自紹興吳越釀酒有限公司釀造（批號(hào)：20150926）。

表1 因素水平表

表2 雅連炮制工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 方差分析表

表4 正交驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n=2）

2 方法與結(jié)果

2.1 炮制工藝研究

2.1.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

黃連生物堿在炮制過(guò)程中，含量呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢(shì)，100℃時(shí)含量升高，在160℃含量達(dá)到最高，小檗堿在超過(guò)160℃含量開(kāi)始下降，分解為小檗紅堿，240℃時(shí)小檗紅堿與小檗堿含量相等，表小檗堿在170℃時(shí)已無(wú)法檢出，黃連堿在240℃時(shí)無(wú)法檢出，同時(shí)出現(xiàn)許多未知峰。因此，選擇炒制，考察因素為悶潤(rùn)時(shí)間（A）、輔料稀釋倍數(shù)（B）、炮制溫度（C）、炮制時(shí)間（D），本著節(jié)能省時(shí)的原則，根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》（2015 版）以及《四川省中藥飲片炮制規(guī)范》（2010版）每個(gè)因素各取3 水平，按4 因素3 水平正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，以黃連總生物堿含量[12]作為指標(biāo)，優(yōu)選炮制工藝。因素水平表見(jiàn)表1。

2.1.2 酒雅連

取黃酒3 份，分別不稀釋、稀釋2 倍、稀釋4 倍，取凈制的雅連100 g，各9 份，按表2 分別編號(hào)1-9，按各試驗(yàn)號(hào)條件，將黃酒或相當(dāng)于原黃酒質(zhì)量12.5 g 的稀釋后的黃酒噴灑在雅連上，混勻后加蓋，悶潤(rùn)，待酒被吸收后，按規(guī)定的溫度，清炒相應(yīng)的時(shí)間，放涼，50 目篩篩去灰屑，打粉，過(guò)2 號(hào)篩，測(cè)定總生物堿含量[12]，篩選最佳炮制工藝。

為了驗(yàn)證上述炮制工藝的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，以保證此工藝的合理可靠，稱(chēng)取雅連藥材約100.0 g，共3份，按上述確定的工藝條件，進(jìn)行重復(fù)3 次的驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明：此工藝具有可重復(fù)性，故確定優(yōu)選的工藝為A2B1C1D2。

2.1.3 姜雅連

稱(chēng)取生姜，置于研缽中，加水研磨2 次，用紗布過(guò)濾，合并濾液，分別制成每1 mL 相當(dāng)于1 g、0.5 g、0.25 g生姜的姜汁。取凈制的雅連100 g，各9 份，按表5 分別編號(hào)1-9，按各試驗(yàn)號(hào)條件，將相當(dāng)于12.5 g 生姜的姜汁噴灑在雅連上，混勻后加蓋，悶潤(rùn)，待濾液被吸收后，按規(guī)定的溫度，清炒相應(yīng)的時(shí)間，放涼，50 目篩篩去灰屑，打粉，過(guò)2 號(hào)篩，測(cè)定總生物堿含量[12]，篩選最佳炮制工藝。

表5 姜黃連炮制工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

結(jié)果表明：影響姜黃連炮制工藝的各因素依次順序?yàn)椋篈 悶潤(rùn)時(shí)間＞D 炮制時(shí)間＞B 輔料稀釋倍數(shù)＞C 炮制溫度（表5）。經(jīng)方差分析，因素A 悶潤(rùn)時(shí)間對(duì)炮制效果均有顯著性影響，故優(yōu)選的炮制工藝條件為：A3B3C2D1，即每100 g雅連加相當(dāng)于12.5 g生姜的0.25 g/mL的姜汁，悶潤(rùn)3 h，130℃清炒5 min（表6）。

表6 方差分析表

為了驗(yàn)證上述炮制工藝的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，以保證此工藝的合理可靠，稱(chēng)取雅連藥材約100.0 g，共3份，按上述確定的工藝條件，進(jìn)行重復(fù)3 次的驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3-7。

驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明：此工藝具有可重復(fù)性，故確定優(yōu)選的工藝為A3B3C2D1。

表7 正交驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n=2）

2.1.4 萸雅連

稱(chēng)取吳茱萸，加水煎煮2 次，用紗布過(guò)濾，分別濃縮成每1 mL 相當(dāng)于1 g、0.5 g、0.25 g 吳茱萸的水煎液。取凈制的雅連100 g，各9 份，按表8 正交表分別編號(hào)1-9，按各試驗(yàn)號(hào)條件，將相當(dāng)于10 g 吳茱萸生藥材的吳茱萸水煎液噴灑在雅連上，混勻后加蓋，悶潤(rùn)，待液體被吸收后，按規(guī)定的溫度，清炒相應(yīng)的時(shí)間，放涼，50 目篩篩去灰屑，打粉，過(guò)2 號(hào)篩，測(cè)定總生物堿含量[12]，篩選最佳炮制工藝。

結(jié)果表明：影響萸雅連炮制工藝的各因素依次順序?yàn)椋篋 炮制時(shí)間＞C 炮制溫度＞B 輔料加量＞A悶潤(rùn)時(shí)間（表8，表9）。經(jīng)方差分析，因素A 悶潤(rùn)時(shí)間、B 輔料加量對(duì)炮制效果均無(wú)顯著性影響，C 炮制溫度、D 炮制時(shí)間對(duì)炮制效果有顯著性影響，結(jié)合節(jié)能省時(shí)的原則，故優(yōu)選的炮制工藝條件為：A1B2C3D1，即每100 g雅連加相當(dāng)于10 g吳茱萸生藥材的0.5 g·mL-1的吳茱萸水煎液，悶潤(rùn)1 h，160℃清炒5 min（表3-9）。

為了驗(yàn)證上述炮制工藝的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，以保證此工藝的合理可靠，稱(chēng)取雅連藥材約100.0 g，共3份，按上述確定的工藝條件，進(jìn)行重復(fù)3 次的驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3-10。

驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明：此工藝具有可重復(fù)性，故確定優(yōu)選的工藝為A1B2C3D1。

表8 萸雅連炮制工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表9 方差分析表

2.2 雅連不同炮制品中7個(gè)生物堿的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

色譜柱Angilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm；流動(dòng)相為乙腈-0.4%磷酸二氫鉀（含有0.4%十二烷基磺酸鈉，0.6%三乙胺，磷酸調(diào)節(jié)pH 9.0）水溶液（34：66）；流速1.0 mL·min-1；柱溫35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)345 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱(chēng)定7 個(gè)對(duì)照品適量，加鹽酸甲醇溶液（1:100），溶解制得每1 mL含有1 mg的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，配制成每1 mL分別含格陵蘭黃連堿、表小檗堿、非洲防己堿、藥根堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿為0.026、0.043、0.030、0.031、0.019、0.029、0.067 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

取雅連生品及各炮制品粉末約0.1 g（過(guò)三號(hào)篩），精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入25 mL鹽酸甲醇（1：100），密塞，稱(chēng)定重量，超聲提取45 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，放置，取上清液，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.2.4 方法學(xué)考察

（1）線(xiàn)性關(guān)系考察

分別精密吸取1.2.2項(xiàng)下各對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，用鹽酸甲醇（1:100）溶液分別稀釋成一系列濃度的混合對(duì)照品溶液。按1.2.1色譜條件注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，以峰面積Y 為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，回歸分析，得回歸方程、相關(guān)系數(shù)（r）及線(xiàn)性范圍，見(jiàn)表2。結(jié)果表明，Groenlandicine、藥根堿、非洲防己堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿，7 個(gè)生物堿分別在0.052 73-1.055（r=0.999 8）μg，0.085 76-1.715（r= 0.999 9）μg，0.051 38 - 1.028（r= 0.999 9）μg，0.038 45 - 0.769 0（r= 0.999 9）μg，0.038 41 - 0.768 2（r= 0.999 9）μg，0.057 - 1.141 0（r= 0.999 9）μg，0.1342-2.684（r=0.999 9）μg，呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

（2）精密度試驗(yàn)

精密吸取同一混合生物堿對(duì)照品溶液，按1.2.1項(xiàng)色譜條件注入高效液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積值，計(jì)算RSD。各生物堿峰面積RSD 分別為0.97%、0.63%、0.84%、0.56%、0.54%、0.76%，表明方法有較好的精密度。

（3）穩(wěn)定性試驗(yàn)

取雅連樣品0.1 g，精密稱(chēng)定，按1.2.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h 時(shí)間按1.2.1項(xiàng)下色譜條件注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，計(jì)算RSD 值。峰面積的RSD 分別為1.11%、1.17%、2.89%、0.60%、0.33%、1.40%、0.63%，說(shuō)明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定可用。

（4）重復(fù)性試驗(yàn)

取0.1 g 的雅連樣品6 份，精密稱(chēng)定，按1.2.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按1.2.1項(xiàng)下色譜條件注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，計(jì)算含量，計(jì)算RSD 值。所測(cè)含量的RSD 分別為1.74%、1.58%、1.90%、2.16%、2.01%、2.17%、1.64%，結(jié)果表明供試品溶液的制備方法重復(fù)性良好。

（5）加樣回收率試驗(yàn)

取雅連樣品6 份，精密稱(chēng)定，每份0.1 g，分別精密加入等量的混合對(duì)照品溶液，按1.2.3項(xiàng)方法制備供試品溶液，按1.2.1 項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算加樣回收率。格陵蘭黃連堿、藥根堿、非洲防己堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿平均回收率分別為97.07%、99.26%、101.60、99.43、98.62%、98.67%、98.68%，RSD

分別為1.07%、0.66%、0.47%、0.47%、0.27%、0.37%、0.29%。表明本法具有較好的回收率。

（6）樣品測(cè)定

分別取同一批次凈制的雅連藥材12份，每份100 g，取3 份直接打粉，過(guò)2 號(hào)篩，3 份按“2.1.2”項(xiàng)下酒黃連炮制法炮制，3 份按“2.1.3”項(xiàng)下姜黃連炮制法炮制，3份按“2.1.4”項(xiàng)下萸黃連炮制方法炮制，炮制后，均打粉，過(guò)2 號(hào)篩，上述12 份黃連樣品按2.2.3 項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算7個(gè)生物堿含量及總生物堿含量（表11）。

表10 正交驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n=2）

表11 雅連生品及炮制品生物堿含量（%）

結(jié)果表明，總生物堿含量：萸雅連＞姜雅連＞生品＞酒雅連；小檗堿含量：姜雅連＞萸雅連＞生品＞酒雅連；巴馬汀含量：萸雅連＞姜雅連＞酒雅連＞生品；黃連堿含量：生品＞萸雅連＞姜雅連＞酒雅連；表小檗堿含量：生品＞萸雅連＞姜雅連＞酒雅連；非洲防己堿含量：生品＞姜雅連＞萸雅連＞酒雅連；藥根堿含量：生品＞姜雅連＞萸雅連＞酒雅連；格陵蘭黃連堿含量：生品＞萸雅連＞姜雅連＞酒雅連。

3 討論

雅連傳統(tǒng)上一直被公認(rèn)為是質(zhì)量最優(yōu)的佳品黃連，其療效受到中醫(yī)藥界廣泛的推崇;《唐本草》中記載：“黃連，蜀道者粗大節(jié)平，味極濃苦，療渴為最”。本課題組研究證實(shí)：炮制后酒雅連的總生物堿含量降低，姜雅連和萸雅連總生物堿含量升高，萸雅連總生物堿含量最高，可能與加入?yún)擒镙桥谥葡嚓P(guān)，吳茱萸中亦含有生物堿類(lèi)化合物。萸雅連降糖效果最佳，優(yōu)于二甲雙胍。

本文對(duì)7個(gè)生物堿成分炮制前后的含量測(cè)定結(jié)果表明：姜雅連和萸雅連炮制后小檗堿、巴馬汀含量升高。小檗堿和巴馬汀是黃連降糖、降脂的有效成分，與雅連療“消渴”直接相關(guān)。降雪[13]等研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿的含量在160℃時(shí)含量達(dá)到最高，超過(guò)160℃開(kāi)始分解為小檗紅堿；巴馬汀的含量在160℃達(dá)到最高，超過(guò)160℃含量開(kāi)始下降；黃連堿在160℃含量達(dá)到最高，240℃完全降解；表小檗堿在170℃就已完全降解；藥根堿的含量幾乎不受溫度影響。在原生物堿分解的過(guò)程中，生成了許多新的成分，這些成分有些也具有其獨(dú)特的活性，因此，在篩選炮制工藝時(shí)，應(yīng)充分考慮到黃連的不同藥理作用，以及不同黃連生物堿的不同活性以及活性的大小，依據(jù)不同作用需要來(lái)權(quán)重黃連多種生物堿降解或保留。同時(shí)，要考慮炮制對(duì)藥性緩和的作用，充分考慮減毒增效。