艾灸對慢性萎縮性胃炎大鼠外周血基因表達譜的影響＊

黃 艷，吳凌翔，馬 喆，顧沐恩，黃儒德，李 璟＊＊，吳璐一，劉慧榮，馬曉芃，張軍峰，張建斌，吳煥淦＊＊

（1. 上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院 上海 200437；2. 上海市針灸經絡研究所 上海 200030；3. 上海中醫藥大學針灸免疫效應重點研究室 上海 200030；4. 南京中醫藥大學 南京 210023）

1 引言

慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis, CAG）以胃黏膜腺體萎縮或消失為主要病變，是臨床常見病和多發病。本病的病因及發病機制不清，可表現為局限性或廣泛性的胃黏膜固有腺萎縮，多并發腸化、上皮內瘤變及炎性反應[1]。Correa 提出人胃癌的發生模式為正常胃黏膜-淺表性胃炎-萎縮性胃炎-小腸型腸上皮化生（以下簡稱“腸化”）-上皮內瘤變（即中重度異型增生）-胃癌（腸型）[2]，尤其是腸上皮化生，被認為是萎縮的典型標示及胃癌的前兆。1978 年WHO 組織將CAG 列為胃癌的癌前狀態。我國目前CAG 的發病率較高，2011 年流行病學調查顯示，CAG 發病率占受檢人群的23.2%。CAG 伴重度腸上皮化生和不典型增生的癌變率為2.0%-13.8%，而我國CAG 癌變率為3%-5%[3]。CAG的患病率隨著患者年齡及病程的增長而升高，但近年來呈低齡化趨勢。目前西醫主要是通過藥物治療和內鏡下微創緩解患者的臨床癥狀，但存在一定的副反應，患者依從性差。針刺、艾灸等方法治療CAG 的療效確切，能改善患者臨床癥狀，提高生活質量[4-6]。其效應機制尚不明確，本研究從外周血全基因組基因表達譜的角度，采用RNA-seq 高通量測序方法篩選CAG 大鼠外周血的差異表達基因，結合生物信息學分析其生物學功能，以及炎癥和腫瘤相關的信號通路，采用RT-qPCR 驗證差異表達基因，為針灸治療CAG的效應機制提供實驗室資料和研究方向。

2 材料與方法

2.1 實驗動物與倫理

清潔級健康雄性Wistar 大鼠，6 周齡，體重（120±5）g，均由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，動物合格證編號：2013001806740，許可證號：SCXK（滬）2012-0002。適應性喂養，其飼養環境：室內溫度24±2℃，濕度為40%-60%，每日明暗時間12 h/12 h。本實驗嚴格按照美國國立衛生研究院制定的動物保護制度執行；遵循《中華人民共和國動物保護法》及上海中醫藥大學實驗動物管理委員會制定的實驗動物使用以及保護條款。

2.2 實驗試劑及材料

N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍（日本東京株式會社，日本），戊巴比妥鈉（Sigma，美國），磁珠蛋白A（Invitrogen，美國），QubitRNA BR 檢測試劑盒（Thermo Fisher，美國），Trizol（Invitrogen，美國），Agilent 2100 RNA 芯片（Illumina，美國），RNA 6000 Nano 總RNA 分析試劑盒（Illumina，美國），Truseq 試劑盒（Illumina，美國），Truseq DNA 樣本制備試劑盒（Illumina，美國），Real-Time PCR System（Roche，美國）。

2.3 模型制備與鑒定

采用隨機的方法將大鼠分成2部分，即正常大鼠6只、造模大鼠18只。采用MNNG 誘導劑結合夾尾刺激與饑飽失常法復制CAG 大鼠模型。動物分籠飼養，每日自由飲用濃度為150 mg·L-1的MNNG 溶液，足量進食2 d，禁食1 d，循環實施。每周用專用夾尾夾夾住大鼠尾部，持續10 min，使之保持激怒、爭奪。造模結束后隨機抽取正常組、造模組各2只大鼠進行模型鑒定。

2.4 干預方法

將造模成功的大鼠隨機分為隔藥餅灸組、電針組、西藥組、模型組，每組4 只；結合前面的正常組4只，共5組。

隔藥餅灸組：用附子、肉桂、黃芩等藥物按照一定比例加工碾粉備用。藥粉與黃酒混合后，用模具制成直徑為1 cm，厚度為0.45 cm 的藥餅，選用精制艾絨制成底座為1 cm，重90 mg 的艾炷。將制好的藥餅置于自制灸具內，置于大鼠中脘穴和氣海穴上，上置艾炷，每天1次，每次每穴1壯，持續4周。

電針組：選取大鼠中脘穴和氣海穴，直刺2 mm，于針柄處接通G6805-2 型電針儀，采用連續波100 Hz，輸出電流1-3 mA，強度以大鼠下肢輕顫為度，每次20 min，每日1次，持續4周。

西藥組：予葉酸懸濁液1.0 mL/100 g（即葉酸2 mg·kg-1）灌胃，每天1次，持續4周。

正常組和模型組不予干預，只做與其它3 組相同的抓取和固定。

穴位定位參照《實驗針灸學》（余曙光主編）大鼠標準穴位圖譜定位。中脘穴：大鼠腹白線上，臍上20 mm；氣海穴：大鼠腹白線上，肚臍下12.5 mm。

2.5 標本采集及處理

取材前各組大鼠禁食不禁水24 h，稱量體重后，2%戊巴比妥鈉麻醉（40-50 mg·kg-1）后，采用EDTA 抗凝管收集腹主動脈血液5 mL，加Trizol 溶液3 mL，凍存-80 ℃冰箱備用。

2.6 總RNA抽提的質控

采用Trizol 法提取總RNA，對抽提的總RNA 進行檢測，觀察其純度、濃度及完整性。并采用安捷倫2100生物芯片分析系統對所得總RNA進行質量控制，RIN 值在8.0 以上的樣本為合格樣本，將應用于RNAseq。

2.7 文庫建立和高通量測序

每組取3 個樣本，采用酶切的方式將各組總RNA隨機打斷成短片段，再以片斷后的RNA 作為樣本模板，用六堿基隨機引物，進行RT-PCR 先合成cDNA 的第一鏈，并加入LIFE INVITROGEN 試劑盒（RNase H、緩沖液、dNTPs 和DNA 聚合酶I），進行RT-PCR 合成cDNA 第二鏈，采用試劑盒純化cDNA，然后采用EB 緩沖液洗脫柱子，完成末端修復、末端加堿基A，再加測序接頭index，然后通過Uracil-N-Glycosylase 降解第二條鏈。將所得產物用1%瓊脂糖凝膠電泳，取出合適的大小片段，進行PCR 擴增。建好文庫后，采用高通量測序儀Illumina HiSeqTM 2000測序。本部分由深圳華大基因股份有限公司完成。

表1 引物的序列表

2.8 生物信息學分析

本部分主要采用了TOPHAT 和CUFFLINKS 結合分析的方法。過濾掉FPKM 和覆蓋度較低的序列，減少背景噪聲，組裝的轉錄本然后再與已知的mRNA 參考序列比較，得到所有基因的mRNA 轉錄本。差異表達基因篩選條件為：log2FC（Fold change）≥1 為基因表達上調；log2FC≤-1為基因表達下調，probility＞0.6。

2.9 RT-qPCR驗證

選取Foxo3、Ifnk、Uba52、S100a1、Nod2共5 個差異表達基因，以GAPDH為內參基因，各組4 個樣本進行RT-qPCR驗證。基因引物序列見表1。所有數據采用2-△△Ct法進行分析。

2.10 統計學方法

采用SPSS22.0 統計軟件包分析數據，描述數據時符合正態分布的數據采用均數±標準差（±s）表示；對于不符合正態分布的數據，采用中位數（四分位數）[Median(P25-P75)]表示。通過正態分布檢驗的數據，采用獨立樣本t檢驗的方法。若不符合正態分布，采用非參數檢驗。檢驗水準α=0.05，P＜0.05 為有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠的大體情況觀察

正常組的大鼠毛發光澤，緊密貼身，兩眼有神，尾淡紅，體型健壯，大便呈顆粒狀。模型組的大鼠毛發蓬亂且毛發易脫落，眼珠無神，尾淡白或蒼白，體型瘦削，活動遲緩，進食少，糞便偏軟、時不成形。隔藥餅灸組、電針組和西藥組的大鼠毛發稀疏，較模型組改善、精神轉佳，活動較靈活，體重有所增加，進食稍增加，糞便偏軟、時不成形。

3.2 CAG大鼠外周血的基因表達譜研究

3.2.1 CAG大鼠外周血的差異表達基因

CAG 大鼠與正常大鼠外周全血基因表達譜變化。與正常組比較，CAG 組有1 542 個差異表達基因，其中上調基因725個，下調基因817個（圖1）。

圖1 CAG大鼠模型組外周全血基因表達譜MA圖

3.2.2 基因本體（GO）分析

與CAG 大鼠外周全血差異表達基因相關的GO分析提示，分子功能：與抗氧化活性、催化活性、金屬輔酶活性、核酸結合轉錄因子活性、信號轉導、轉錄因子活性、蛋白結合及結構分子活性相關。生物學途徑：與單一生物過程、信號、應激反應、調節生物過程、突觸、正反饋和負反饋、代謝過程、免疫系統、細胞成分和生物作用、生物粘附等相關。細胞組件：與細胞連接、細胞外基質、大分子復合物、膜、細胞器、突觸等相關（圖2）。

圖2 CAG大鼠外周血差異表達基因的GO分析

3.2.3 信號通路（KEGG）分析

與CAG 大鼠外周全血差異表達基因相關的KEGG 分析提示，主要與細胞生長和死亡、細胞運動、運輸和分解代謝、信號轉導、信號分子和相互作用、癌癥、心血管疾病、內分泌代謝疾病、免疫疾病、細菌感染、神經退行性疾病、物質依賴、氨基酸代謝、碳水化合物代謝、能量代謝、糖鏈生物合成和代謝、脂質代謝、輔助因子和維生素的代謝、其他氨基酸的代謝、萜類化合物和聚酮化合物的代謝、核苷酸代謝、異生素生物降解和代謝、衰老、消化系統、內分泌系統、環境適應、免疫系統、神經系統、感覺系統等相關（圖3）。

3.3 隔藥餅灸、電針和西藥對CAG 大鼠外周血表達基因譜的影響

MNNG 誘導的CAG 大鼠在隔藥灸干預作用下，外周血較模型組的差異表達基因2 956 個，其中上調1 012 個，下調1 944 個。下調基因數目明顯多于上調基因數目，占65.76%。電針干預作用下，外周血較模型組的差異表達基因3 136 個，其中有的上調885 個，有部分下調2 251 個。下調基因數目明顯多于上調基因數目，占71.78%。在西藥組的干預下，外周血較模型組的差異表達基因1 308 個，其中有的上調703 個，有部分下調605個。上調基因數目稍多于下調基因數目，占53.75%。

圖3 CAG大鼠外周全血差異表達基因的KEGG分析

3.3.1 隔藥餅灸干預CAG 模型大鼠外周全血的基因表達譜研究

（1）隔藥餅灸干預CAG 模型大鼠外周血的差異表達基因

隔藥餅灸組大鼠與CAG 模型大鼠外周全血基因表達譜變化，與模型組比較，隔藥餅灸組有2 956 個差異表達基因，其中上調1 012個，下調1 944個（圖4）。

圖4 隔藥餅灸組與CAG模型組外周全血基因表達譜MA圖

（2）基因本體（GO）分析

隔藥餅灸干預CAG 大鼠的外周全血差異表達基因相關的GO 分析提示，分子功能：與抗氧化活性、催化活性、金屬輔酶活性、核酸結合轉錄因子活性、信號轉導、轉錄因子活性、蛋白結合及結構分子活性相關。生物學途徑：與單一生物過程、信號、應激反應、調節生物過程、突觸、正反饋和負反饋、代謝過程、免疫系統、細胞成分和生物作用、生物粘附等相關。細胞組件：與細胞連接、細胞外基質、大分子復合物、膜、細胞器、突觸等相關（圖5）。

圖5 隔藥餅灸組大鼠外周全血基因表達譜GO分析

（3）KEGG分析

隔藥餅灸組外周全血的差異基因的KEGG分析結果提示，其中基因涉及KEGG主要與細胞生長與死亡、細胞運動、運輸與分解代謝、信號分子和相互作用、信號轉導、蛋白質折疊與分選、復制與修復、癌癥、免疫疾病、物質氨基酸代謝、能量代謝、脂質代謝、輔助因子和維生素代謝、核苷酸代謝、消化系統、免疫系統、神經內分泌系統等相關（圖6）。

3.3.2 電針干預CAG 模型大鼠外周全血的基因表達譜研究

（1）電針干預CAG 模型大鼠外周血的差異表達基因

電針組大鼠與CAG 模型大鼠外周全血基因表達譜變化，與模型組比較，電針組有3136 個差異表達基因，其中上調885個，下調2251個（圖7）。

圖6 隔藥餅灸組大鼠外周全血基因表達譜KEGG分析

圖7 電針組與CAG模型組外周全血基因表達譜MA圖

（2）GO分析

電針干預CAG 大鼠的外周全血差異表達基因相關的GO 分析提示，分子功能：與抗氧化、催化活性、金屬輔酶活性、核酸結合轉錄因子活性、信號轉導、轉錄因子活性、蛋白結合及分子活性相關。生物學途徑：與單一生物過程、信號、應激反應、調節生物過程、正反饋和負反饋、代謝過程、免疫系統、細胞成分和生物作用、生物粘附等相關。 細胞組件：與突觸、細胞器、細胞膜、細胞、細胞連接、細胞外基質、大分子復合物等細胞組件相關（圖8）。

圖8 電針組大鼠外周全血基因表達譜GO分析

（3）KEGG分析

電針組外周全血的差異基因的KEGG分析結果提示，其中基因涉及KEGG主要與細胞生長與死亡、細胞運動、運輸與分解代謝、信號分子和相互作用、信號轉導、蛋白質折疊與分選、復制與修復、癌癥、免疫疾病、物質氨基酸代謝、能量代謝、脂質代謝、輔助因子和維生素代謝、核苷酸代謝、消化系統、免疫系統、神經內分泌系統等相關（圖9）。

圖9 電針組大鼠外周全血基因表達譜KEGG分析

3.3.3 西藥干預CAG 模型大鼠外周全血的基因表達譜研究

（1）西藥干預CAG 模型大鼠外周全血的差異表達基因

西藥組大鼠與CAG 模型大鼠外周全血基因表達譜變化。與模型組比較，西藥組有1 308 個差異表達基因，其中上調703個，下調605個（圖10）。

圖10 西藥組與CAG模型組外周全血基因表達譜MA圖

（2）GO分析

西藥干預CAG 大鼠的外周全血差異表達基因相關的GO 分析提示，分子功能：與抗氧化活性、催化活性、金屬輔酶活性、核酸結合轉錄因子活性、信號轉導、轉錄因子活性、蛋白結合及結構分子活性相關。生物學途徑：與單一生物過程、信號、應激反應、調節生物過程、突觸、正反饋和負反饋、代謝過程、免疫系統、細胞成分和生物作用、生物粘附等相關。細胞組件：與細胞連接、細胞外基質、大分子復合物、膜、細胞器、突觸等相關（圖11）。

圖11 西藥組大鼠外周全血基因表達譜GO分析

（3）KEGG分析

西藥組外周全血的差異基因的KEGG分析結果提示，其中基因涉及KEGG主要與細胞生長與死亡、細胞運動、運輸與分解代謝、信號分子和相互作用、信號轉導、癌癥、免疫疾病、物質氨基酸代謝、能量代謝、脂質代謝、輔助因子和維生素代謝、核苷酸代謝、消化系統、免疫系統、神經內分泌系統等相關（圖12）。

圖12 西藥組大鼠外周全血基因表達譜KEGG分析

3.4 隔藥餅灸影響的CAG 外周全血差異表達基因的驗證

RNA-seq 測序結果提示，CAG 大鼠外周全血Foxo3、Ifnk和Uba52較正常組下調，S100a1、Nod2較正常組上調。采用RT-qPCR 驗證這5 個基因，結果發現CAG大鼠外周全血基因Foxo3mRNA、Uba52mRNA 表達均較正常組降低（P＜0.05），IfnkmRNA 表達有下降趨勢，但差異無統計學意義；CAG 大鼠外周全血S100a1mRNA、Nod2mRNA 表達均較正常組上調（P＜0.05）。經3 種干預方法作用后，隔藥餅灸組、電針組、西藥組CAG大鼠外周全血Foxo3mRNA、Uba52mRNA均較模型組上調（P＜0.05），S100a1、Nod2較模型組下調（P＜0.05），三組IfnkmRNA 表達較模型組有上升趨勢，但差異無統計學意義（圖13）。

圖13 各組部分外周全血差異表達基因的驗證

4 討論

CAG 在中醫學古籍中沒有相關記載，2010年中華中醫藥學會正式將CAG 歸屬為“胃痞”、“胃痛”、“嘈雜”、“痞滿”、“腹脹”等范疇。本病發病多與稟賦不足、勞倦過度、飲食不節、情志不調、感受外邪等因素相關，病機錯綜復雜，病情遷延難愈，早期多因外邪、飲食、情致等所傷為實證，后期病機逐漸演變為脾胃虛弱等虛證，屬本虛標實。相對于西醫學主張對癥治療的觀點，中醫學更側重于整體調節和辨證論治。針刺、艾灸等方法治療CAG 的療效確切，相關臨床研究已證實[4-9]，本研究采用隔藥餅灸方法治療CAG，以充分發揮經絡、腧穴及藥物的治療作用。

隨著基因芯片和RNA-seq 高通量測序技術的發展，CAG 疾病相關的基因及其生物學功能逐漸被揭示，CAG 胃黏膜組織部分炎癥因子、促癌基因和抑癌基因異常表達。我們思考隔藥餅灸對CAG 發揮調節免疫、細胞凋亡的作用，以及調控促癌基因與抑癌基因的平衡。本研究從全基因組基因表達譜的角度，采用RNA-seq 高通量測序的方法，探討MNNG 誘導的CAG 外周全血基因表達譜，并篩選隔藥餅灸中脘、氣海穴逆轉CAG 大鼠外周全血的差異表達基因。

本研究發現，MNNG 誘導的CAG 大鼠在3 種干預方法的作用下，外周血差異表達基因均有不同程度的上調或下調，其中隔藥餅灸和電針調控的差異基因數目較西藥多，可能與針灸作用的多環節、多靶點相關。3 種干預方法作用下的KEGG 途徑富集分析主要與細胞生長與死亡、細胞運動、運輸與分解代謝、信號分子和相互作用、信號轉導、癌癥、免疫疾病、能量代謝、脂質代謝、輔助因子和維生素代謝、核苷酸代謝、消化系統、免疫系統、神經內分泌系統等相關，富集基因數目最多的通路主要與蛋白翻譯、信號轉導、癌癥、免疫系統、消化系統等相關。

GAG 大鼠外周血差異基因表達譜廣泛，我們篩選了差異倍數較顯著的Foxo3、Uba52、S100a1、Nod2、Ifnk等5個基因，RNA-seq測序結果提示，CAG大鼠外周全血Foxo3、Ifnk和Uba52較正常組下調，S100a1、Nod2較正常組上調。采用RT-qPCR 對RNA-seq 測序結果進一步驗證，結果發現CAG 大鼠外周全血基因Foxo3mRNA、Uba52mRNA 表達均較正常組降低，S100a1mRNA、Nod2mRNA 表達均較正常組升高，IfnkmRNA表達均較正常組亦有降低趨勢；經3 種干預方法作用后，CAG 大鼠外周全血Foxo3mRNA、Uba52mRNA 表達均較模型組升高，S100a1、Nod2表達均較模型組降低，IfnkmRNA 表達較模型組亦有上升趨勢。研究表明，叉頭蛋白Foxo3 參與調節細胞周期、細胞凋亡等的病理過程，可通過激活PI3K-AKT 信號通路參與CAG癌前病變的調節，與消化道腫瘤的發生密切相關[10-14]。S100a1是鈣結合蛋白S100家族的成員，在細胞中既有信號分子的作用同時又可作為分泌蛋白起作用，與多種神經病變、癌癥相關[15，16]，研究表明，S100a1 可通過刺激胃癌細胞內鈣水平在胃癌細胞呈高表達趨勢[17]。UBA52 是由泛素和核糖體蛋白L40 組成的融合蛋白，其主要參與了糖尿病腎病的發病機制，并與結腸癌、乳腺癌等相關[18-21]。HP 感染是CAG 重要的危險因素，NOD2 作為核苷酸結合寡聚化結構域蛋白家族的關鍵成員，可通過識別和清除外源性病原微生物、介導天然免疫，是抵御Hp 感染的第一道防線，并參與Hp 相關胃癌的發生、發展過程[22-25]。Ifnk（interferon kappa,IFN-κ）是近來發現的Ⅰ型干擾素家族成員，在先天免疫應答期起著重要作用，具有與其它Ⅰ型干擾素家族成員相似的抗病毒感染的功能[26,27]。綜上，本研究所驗證的Foxo3、Uba52、S100a1、Nod2等4 個差異基因的mRNA 表達趨勢與測序結果一致，可能是CAG 的潛在的生物標志物；在隔藥餅灸的干預作用下，Foxo3、Uba52、S100a1、Nod2的mRNA 表達水平均有不同程度的逆轉，可能是隔藥餅灸干預CAG 大鼠的外周血的作用機制之一。

基因表達譜研究為我們提供了研究方向，下一步將從表觀遺傳的角度結合RNA-seq 基因表達譜，研究DNA 甲基化和長鏈非編碼RNA 在艾灸治療CAG 的效應機制。