Cu2+脅迫對亮斑扁角水虻幼蟲血淋巴能量物質水平的影響

孫虹霞,吳啟仙,廖 業,高嘉敏,柳 琳,夏 嬙

(遵義醫學院珠海校區 免疫學與病原生物學教研室,廣東 珠海 519041)

亮斑扁角水虻(HermetiaillucensL.)俗稱黑水虻，是雙翅目水虻科重要的資源昆蟲，其幼蟲可以有效消耗和降解多種有機物質，如畜禽糞便、腐爛有機物等[1]，被世界各國廣泛用于動物糞便無公害化處理。其處理后副產品含有較高水平的粗蛋白、粗脂肪[2]、月桂酸[3]、肉豆蔻酸及人體和禽畜體內所需的多種氨基酸，在飼料及醫藥研發中亦具有無限的潛能[4]。

Cu作為一種有效的促生長劑廣泛添加于禽畜飼料中，但禽畜對飼料中Cu2+的利用率較低，90%以上通過糞便排出體外，造成糞便中Cu2+的大量累積。研究表明，北京規?；B殖場豬糞中Cu2+最高含量可達1 170.00 mg/kg[5]，河北、四川等地禽畜糞便中Cu2+含量亦超標嚴重，豬糞中Cu超標率達到80%以上[6-7]。課題組前期研究表明，Cu2+可在亮斑扁角水虻幼蟲表皮、血淋巴、脂肪體及中腸中累積，并對其生長發育產生影響[8]。

血淋巴是昆蟲能量物質和代謝的主要場所。在血淋巴中，糖、脂和氨基酸等能量物質依照特定的代謝途徑提供生長發育所需的營養物質，隨后被中腸吸收并存儲在脂肪體內供蟲體生命活動所需。然而，重金屬的積累可通過影響昆蟲食物利用率和轉化率等影響血淋巴中的能量物質代謝，并對其生長發育產生促進或阻抑作用[9]，影響程度與重金屬的種類、昆蟲種類和發育階段都存在著一定的關聯[10]。前期研究表明，累積在亮斑扁角水虻幼蟲體內的Cu2+對亮斑扁角水虻的生長發育產生了影響，并存在低劑量促進而高劑量抑制的現象[8]；我們推測其對幼蟲血淋巴的能量代謝也產生了影響，但影響的程度如何？在不同發育階段有何異同？是否與飼料中的Cu2+劑量存在相關性？對這些問題的回答，可對我們了解重金屬對亮斑扁角水虻能量物質代謝的影響，以及其作為蛋白質和脂類替代物潛能的影響提供一定的理論支持。

鑒于此，本研究將不同濃度Cu2+添加至人工飼料中，連續5代脅迫亮斑扁角水虻幼蟲。隨后，檢測Cu2+在不同脅迫世代亮斑扁角水虻6齡幼蟲體內的積累，并探討Cu2+對不同發育階段亮斑扁角水虻幼蟲血淋巴中能量物質總糖、蛋白質和脂類水平的影響，以期闡述Cu2+脅迫對亮斑扁角水虻幼蟲能量物質代謝的影響程度。

1 材料與方法

1.1 實驗昆蟲及Cu2+脅迫處理 亮斑扁角水虻：珠海市現代農業發展中心提供；飼養條件：溫度為(27±3)℃，光照周期為14 L：10D，濕度為(80 ± 8)%。將不同劑量的CuSO4·5H2O添加至亮斑扁角水虻人工飼料中，使飼料中的Cu2+終濃度分別為75、150、300、600、1200 mg/kg(質量比)，以不添加Cu2+飼料飼養亮斑扁角水虻幼蟲為對照(記為0 mg/kg)。以第1代幼蟲化蛹后，羽化成蟲所產卵作為第2代蟲源，第3代以此類推。每天更換飼料并連續脅迫5個世代。每個重金屬濃度處理設3個重復，每個重復60頭幼蟲。

1.2 主要試劑及儀器 CuSO4·5H2O購自廣州試劑一廠、N-Phenylthiourea購自Alfa Aesar公司、磺基水楊酸購自天津市大茂化學試劑廠、蒽酮購自上海市國藥集團化學試劑有限公司、香蘭素購自上海市國藥集團化學試劑有限公司，以上試劑均為分析純；考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒購自南京建成科技有限公司。等離子體原子發射光譜儀ICP-AES，Thermo Jarrell Ash Corporation生產；紫外可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司，型號：UV752；臺式高速冷凍離心機，Thermo公司，型號：Multifuge X1R。

1.3 幼蟲血淋巴中Cu2+濃度的測定 選取長勢均一的不同濃度Cu2+處理的6齡幼蟲各30頭，清潔蟲體后，斷頭法取血淋巴，烘干后置于稱量瓶中，依照夏嬙等(2008)[11]的方法對對照和各處理蟲體的血淋巴進行消化，并按照下列公式計算血淋巴中的Cu2+濃度：Cu2+濃度=C×50/W(mg/kg)，其中C為ICP-AES檢測結果，W為樣品干重。

1.4 幼蟲血淋巴能量物質測定 分別選取75、150、300、600、1 200 mg/kgCu2+脅迫下長勢均一的第1、3、5代5齡始至6齡末亮斑扁角水虻幼蟲，分別記為0、24、48、72、96、120 h幼蟲，每個時間段幼蟲均為20只，清潔消毒后斷頭取血淋巴，加入含有N-Phenylthiourea的Eppendorf管中，混勻，4 ℃ 15 000 rpm離心5 min，取上清，每個處理3個重復。蒽酮比色法測定幼蟲血淋巴中總糖含量，以0.01%葡萄糖制作標準曲線；考馬斯亮藍法測定幼蟲血淋巴中蛋白質含量，蛋白濃度(g/L)= (測定管A值-空白管A值) /(標準管A值-空白管A值)× 標準管濃度(0.563 g/L)× 稀釋倍數(200倍)；磷酸香草醛顯色法測定幼蟲血淋巴中脂肪含量，以膽固醇(含2.5 mg/mL甲醇)制作標準曲線。

1.5 統計學方法 采用SPSS 19.0統計分析軟件，計量資料兩組間采用配對t檢驗；多組間采用單因素方差分析，P<0.05具有統計學差異。

2 結果

2.1 Cu2+在亮斑扁角水虻幼蟲血淋巴內的積累 隨著飼料中Cu2+濃度的增加，同一世代亮斑扁角水虻幼蟲血淋巴中Cu2+含量呈遞增的趨勢，且各世代中受600和1 200 mg/kg處理蟲體血淋巴中積累的Cu2+濃度顯著高于對照和其它處理中的濃度。與對照相比，75和150 mg/kg Cu2+的脅迫也顯著增加了第5代幼蟲血淋巴中的Cu2+濃度。

隨著脅迫世代數的增加，同一濃度脅迫下的亮斑扁角水虻幼蟲血淋巴中Cu2+含量也呈遞增的趨勢。然而，只有受1 200 mg/kg Cu2+脅迫幼蟲血淋巴中的Cu2+濃度在第1、3和5世代中存在顯著差異(見表1)。

Cu2+濃度(mg/kg)亮斑扁角水虻幼蟲血淋巴中Cu2+濃度(mg/L)第1代第3代第5代02.31±0.44c2.57±0.91def2.94±0.88d753.24±0.14c3.45±0.20de4.42±0.11cd1503.64±0.98bc4.00±0.21cd4.60±0.33c3004.78±0.09b5.03±0.16c5.53±0.20c6005.83±0.32b6.60±0.28b7.13±0.31b1 2008.68±0.40a11.40±0.30a#17.56±0.95a#

表中同一列平均數后不同小寫字母表示同一世代不同濃度重金屬處理間差異具有統計學意義(P<0.05)；#:表示同一重金屬處理濃度下的第3、5代含量與第1代相比具有統計學意義(P<0.05)。

2.2 Cu2+脅迫對亮斑扁角水虻幼蟲血淋巴總糖含量的影響 不同濃度Cu2+脅迫對第1、3、5代亮斑扁角水虻幼蟲(0～120 h)血淋巴中總糖含量的影響及方差分析(見圖1)。

在各個發育節點，第1、3和5代幼蟲血淋巴中的總糖含量均低于對照蟲體中的含量(除第3代24 h和120 h取樣點)，并隨飼料中Cu2+濃度的增加而減少。在受Cu2+脅迫的第1代幼蟲血淋巴中，0～24 h和96～120 h時間點的總糖含量只在受1 200 mg/kg Cu2+處理中顯著降低，而48～72 h時間點的總糖含量在各處理中均顯著下降(P<0.05)。脅迫至第3代，各時間點受600～1 200 mg/kg Cu2+處理幼蟲血淋巴中的總糖含量在均顯著低于對照，但第24 h時間段幼蟲血淋巴中的總糖含量在75～150 mg/kg處理濃度下顯著高于對照組(P<0.05)。對第5代數據的分析表明，150～1 200 mg/kg Cu2+脅迫均顯著降低了第5代亮斑扁角水虻幼蟲(0～120 h)血淋巴中總糖含量(P<0.05)。

隨著脅迫世代數的增加，亮斑扁角水虻幼蟲血淋巴中的總糖含量呈下降的趨勢。就同一處理濃度下的總糖含量而言，0 h取樣點的含量在各世代間不存在顯著差異；24 h和120 h取樣點的含量在第1、5世代間沒有顯著差異，但均低于第5代中的含量；在第48～96 h取樣點，第1、3代不存在顯著差異，但顯著低于第5代中的含量(P<0.05)。

A:0 h; B:24 h; C:48 h; D:72 h; E:96 h; F:120 h。每取樣點柱形圖中，不同的小寫字母表示同一世代蟲體血淋巴中的總糖含量在不同重金屬處理間存在顯著差異(P<0.05)；不同大寫字母表示同一重金屬處理下血淋巴中的總糖含量在不同世代間存在顯著差異(P<0.05)。圖1 第1、3、5代亮斑扁角水虻幼蟲不同濃度Cu2+脅迫后0～120 h血淋巴的總糖含量

2.3 Cu2+脅迫對亮斑扁角水虻幼蟲血淋巴蛋白質含量的影響 在各處理濃度Cu2+脅迫下，第1代幼蟲(0～120 h)血淋巴中的蛋白質含量與對照組相比均顯著增加(P<0.05)，而第3、5代各時間點幼蟲血淋巴中的蛋白質含量均顯著低于對照。此外，各處理幼蟲血淋巴中的蛋白質含量隨Cu2+濃度的增加呈下降的趨勢。同時，在同一濃度的Cu2+脅迫下，各時間點的第1、3、5代幼蟲血淋巴中的蛋白質含量在各世代間均存在顯著差異(P<0.05，見圖2)。

A:0 h; B:24 h; C:48 h; D:72 h; E:96 h; F:120 h。每取樣點柱形圖中，不同的小寫字母表示同一世代蟲體血淋巴中的蛋白質含量在不同重金屬處理間存在顯著差異(P<0.05)；不同大寫字母表示同一重金屬處理下血淋巴中的蛋白質含量在不同世代間存在顯著差異(P<0.05)。圖2 第1、3、5代亮斑扁角水虻幼蟲不同濃度Cu2+脅迫后0～120 h血淋巴的蛋白質含量

2.4 Cu2+脅迫對亮斑扁角水虻幼蟲血淋巴脂肪含量的影響 不同濃度Cu2+脅迫對第1、3、5代亮斑扁角水虻幼蟲血淋巴中脂肪含量的影響及方差分析如圖3所示。

結果表明，除第1代0 h時間段的幼蟲外(但各處理濃度間及與對照間差異均不顯著)，各時間點第1、3、5世代幼蟲血淋巴中的脂肪含量均隨飼料中Cu2+濃度的增加而減少，且150～1 200 mg/kg處理濃度Cu2+脅迫均顯著降低了第1、3、5代亮斑扁角水虻幼蟲(0～120 h)血淋巴中脂肪含量。

隨著脅迫世代數的增加，第3、5代亮斑扁角水虻幼蟲血淋巴中的脂肪含量在300～1 200 mg/kg Cu2+脅迫下(除去72 h、96 h)顯著低于第1代(P<0.05)。

A:0 h; B:24 h; C:48 h; D:72 h; E:96 h; F:120 h。每取樣點柱形圖中，不同的小寫字母表示同一世代蟲體血淋巴中的脂肪含量在不同重金屬處理間存在顯著差異(P<0.05)；不同大寫字母表示同一重金屬處理下血淋巴中的脂肪含量在不同世代間存在顯著差異(P<0.05)。圖3 第1、3、5代亮斑扁角水虻幼蟲不同濃度Cu2+脅迫后0～120 h血淋巴的脂肪含量

3 討論

重金屬能在生物體內積累并干擾生物的正常新陳代謝，其中，能量物質代謝的變化是機體對重金屬脅迫的反應之一。在本研究中，我們發現重金屬Cu2+可在亮斑扁角水虻血淋巴中積累，并隨脅迫濃度的增加而增加。其中，第1、3和5代的總糖含量(除第2代24 h和120 h取樣點)和脂肪含量均隨Cu2+濃度的增加而遞減；除第1代外，蛋白質含量也隨Cu2+濃度的增加而呈遞減的趨勢。同時，隨著脅迫世代數的增加，各處理濃度下的能量物質的含量與對照的差異也趨于顯著。

前期研究證實，Cu2+可在亮斑扁角水虻幼蟲體內積累，并可存儲在表皮、中腸和脂肪體等組織內。各組織中的重金屬含量隨飼料中Cu2+濃度的增加而增加，并表現為中腸>脂肪體>表皮的規律[12]。通常，過量的重金屬可通過中腸上皮細胞基底膜進入血淋巴，并通過血淋巴轉運至脂肪體和表皮等組織。因此，我們在亮斑扁角水虻的血淋巴中也檢測到了Cu2+的存在，并存在與其它組織類似的積累規律。

研究表明，昆蟲體內能量物質如碳水化合物、蛋白質和脂質等會因重金屬的脅迫而發生變化[13-14]，并與昆蟲的種類、重金屬的種類及濃度相關[15]。在本研究中，亮斑扁角水虻幼蟲血淋巴中的能量物質也對Cu2+的脅迫產生了應激反應。亮斑扁角水虻在受Cu2+脅迫的第1代幼蟲血淋巴中，各時間段的總糖和脂肪含量均隨脅迫濃度的增加而下降，但蛋白質含量均高于對照組的含量。總糖和脂肪含量的下降是生物體對毒性作用的反應機制之一，這與雙翅目昆蟲搖蚊和棕尾別麻蠅對Cd2+脅迫的反應類似[16-17]；同時，脂肪含量的減少可能也意味著其代謝物可為蛋白質的合成提供底物分子。因此，在Cu2+脅迫相對較短(1個世代)的時間內，亮斑扁角水虻幼蟲迅速調整了糖、蛋白質和脂類的代謝過程，以防御Cu2+對機體的脅迫作用。

和對照相比，第3、5代幼蟲血淋巴中的總糖、蛋白質和脂肪含量均呈下降的趨勢。例外的是，第3代24 h和120 h時間點的受Cu2+脅迫幼蟲血淋巴中的總糖含量高于對照蟲體中的含量。這兩個時間節點分別對應5齡期和6齡期幼蟲的初始發育階段，總糖含量的增高，可能是幼蟲為保持糖原穩點性的應激反應。此外，Cu2+可刺激水生生物CyprinuscarpioL.血淋巴中蛋白質的代謝，其分解產生的氨基酸可作為糖類或其它物質合成的底物[18]。但本研究中糖和蛋白質代謝的關聯還有待于進一步的研究。再者，在Cu2+的持續脅迫下，血淋巴中漸增的Cu2+濃度最終損害了幼蟲的能量代謝過程，顯著降低了第5代血淋巴中的能量物質的含量，這可能也意味著幼蟲在對Cu2+的解毒過程中消耗了相對較多的能量。這些結果與家蠅幼蟲血淋巴能量物質儲備隨著Cd劑量增加而下降的報道相一致[19]；與此類似，甲殼類動物在受到重金屬脅迫后血淋巴的熱量值也呈下降的趨勢[20]。然而，低濃度Zn2+處理增加而高濃度Zn2+脅迫降低了亮斑扁角水虻血淋巴中的能量物質[21]；受Ni2+長期脅迫的斜紋夜蛾幼蟲可通過提高蛋白質含量，降低總糖和脂肪含量以滿足能量的需求[10]。這些研究也表明，重金屬對昆蟲能量物質含量的影響與重金屬的種類和昆蟲種類等都存在一定的關聯。

相關的研究證實，海藻糖和糖原是最易受重金屬脅迫影響的糖類物質；重金屬如Pb等可通過與蛋白質的-SH基或其它基團的相互作用，改變其結構或功能，進而影響其合成代謝[21]；而一些水生生物肝臟中的糖原、蛋白質和脂肪合成代謝酶如天冬氨酸轉氨酶AST、乳酸脫氫酶LDH和蘋果酸脫氫酶MDH等的活性在重金屬脅迫下也會增加[22]，以提高能量物質的代謝率防御重金屬的脅迫作用。然而，在昆蟲的研究中還未見相關報道，Cu2+脅迫對亮斑扁角水虻幼蟲能量物質影響的具體機制還有待于進一步的研究。