IDH1 R132H、HIF-1α及VEGF在腦膠質瘤中的表達及與臨床病理特征的關系

于佳龍，黃南渠，施尚鵬，李 航,劉華慶，羅 勇

(1.遵義醫學院第三附屬醫院 急診科，貴州 遵義 563000；2.遵義醫學院第三附屬醫院 藥物臨床試驗機構，貴州，遵義 563000；3.遵義醫學院第三附屬醫院 神經外科，貴州 遵義 563000；4.遵義醫學院附屬醫院 病理科，貴州 遵義 563099；5.遵義醫學院第三附屬醫院 神經內科，貴州 遵義 563000)

膠質瘤是最常見的顱內惡性腫瘤，起源于神經膠質細胞，約占原發性腦腫瘤的60%以上，據統計，中國腦膠質瘤年發病率為3～6人/10萬人，年死亡人數達3萬人[1-2]，腦膠質瘤傳統上被世界衛生組織(World Health Organization,WHO)按惡性程度劃分為4個等級，表示為I至IV，其中I、II型為低級別腦膠質瘤，III、IV型為高級別腦膠質瘤[3]。因其發病機制復雜，而現有的手術及替莫唑胺等藥物輔助治療效果欠佳[4]，因此對腦膠質瘤的發病機制及進一步治療方案的研究成為重點。

近年來，隨著基因組學的蓬勃發展，腦膠質瘤的諸多分子標志物相繼被發現，有研究顯示異檸檬酸脫氫酶(Isocitrate dehydrogenase,IDH)突變與腦膠質瘤的發生發展關系較為密切。Parsons等2008年在膠質母細胞瘤的外顯子組測序中發現超過20%的腫瘤樣本中發現了IDH1基因在第132位的精氨酸(R)轉換為組氨酸(H)，隨著對IDH的深入研究，Hartmann等在2009年發現IDH1 R132H基因突變為腦膠質瘤中的最常見的基因突變[5-6]，學者在惡性腫瘤的癌前病變中發現缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)的過度表達，其中乳腺癌中最為明顯[7]。秦華平等[8]通過用SABC免疫組化法證明HIF-1α蛋白在膠質瘤中明顯表達。相關實驗結果表明，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)為腦膠質瘤血管生成的重要環節，且腦膠質瘤中的VEGF均高表達(正常腦組織幾乎不表達)，參與著腦膠質瘤的血管生成及侵襲過程[9-10]。目前僅偶見有關于三者在腦膠質瘤中的表達及相關機制的研究。因此，本研究擬選取51例腦膠質瘤患者石蠟切片及10例非膠質瘤正常腦組織的存檔石蠟切片，通過免疫組織化學法檢測IDH1 R132H、HIF-1α及VEGF的表達，研究三者的表達情況及與臨床病理特征之間的關系。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選取2007年1月～2017年12月遵義市第一人民醫院、遵義醫學院附屬醫院、貴州航天醫院3家醫院的51例腦膠質瘤手術切除標本的石蠟切片及10例正常腦組織切片(交通事故尸體解剖后保留的腦組織)，每個組織切4張切片。所有病理切片經HE染色后重新按照腦膠質瘤2016 WHO分級標準進行分級[3]。其中I級13例，II級17例，III級14例，IV級7例。患者術前均未行放化療治療，且均為首發病例。男性26例，女性25例。年齡分組[11]：<45歲(青年組)28例，45～59歲(中年組)14例，≥60歲(老年組)9例。腫瘤部位：額葉14例，顳葉13例，枕葉6例，頂葉5例，其他部位13例。

1.2 實驗試劑 即用型一抗：兔抗人HIF-1α單克隆抗體、兔抗人VEGF-A多克隆抗體及小鼠抗人IDH1(R132H)單克隆抗體(一抗工作濃度均為1∶100)。二抗：HRP標記的山羊抗小鼠/兔IgG聚合物、增強劑、抗原修復液、PBS、防脫玻片、免疫組化筆均購于北京中杉金橋生物公司。

1.3 實驗方法 將存檔的51例腦膠質瘤患者及10例正常腦組織的石蠟標本進行切片，切片厚度為4 μm，然后進行免疫組化PV-9000(Polink-2 plus)二步法染色，蘇木精復染，中性樹膠封固。其中IDH1 R132H 用已有的腦膠質瘤標本作陽性對照，HIF-1α用乳腺癌組織作陽性對照，VEGF用肝癌組織作陽性對照。組織抗原均采用高溫修復(微波爐中火加熱12 min)，上述操作嚴格按照試劑盒說明書執行。

1.4 結果判讀 IDH1R132H及HIF-1α主要表達在細胞核，VEGF蛋白主要表達在細胞質，3個指標的陽性信號主要表現為棕黃色或褐色染色，由2名病理科醫師采用雙盲法閱片，依照陽性細胞數量進行判定，在5個高倍鏡視野下(10×40倍)將無陽性細胞數或陽性細胞數<1%定性為陰性，將陽性細胞>1%定性為陽性[12]。

1.5 統計學處理 采用SPSS 18.0對數據進行統計分析。計數資料采用例(百分比)表示，無序分類變量用χ2檢驗，等級資料用秩和檢驗，組間關聯性分析用行×列表χ2檢驗做關聯性分析，檢驗水準均取α=0.05。

2 結果

2.1 腦膠質瘤組與對照組的臨床資料及目標蛋白的表達情況 HIF-1α表達方面：對照組10例均陰性，腫瘤組27例陰性表達，24例陽性表達，經分析存在統計學差異(P<0.05)。VEGF表達方面：對照組10例均陰性，腫瘤組20例陰性表達，31例陽性表達，經分析存在統計學差異(P<0.05)。而IDH1R132H方面：對照組10例均陰性，腫瘤組陰性表達30例，陽性表達21例，經分析存在統計學差異(P<0.05,見表1、圖1～2)。

表1腦膠質瘤組與對照組的基本情況比較

指標對照組例數%腫瘤組例數%χ2/ZP性別0.4030.525 男440.002650.98 女660.002549.02年齡分組0.3570.837 <45歲660.002854.90 45^59歲330.001427.45 ≥60歲110.00917.65分級43.032<0.001 正常腦組織10100.0000.00 I級00.001121.57 II級00.002039.22 III級00.001427.45 IV級00.00611.76IDH1R132H 6.2790.012 陰性10100.003058.82 陽性00.002141.18HIF-1α 7.7580.005 陰性10100.002752.94 陽性00.002447.06VEGF 12.329<0.001 陰性10100.002039.22 陽性00.003160.78三個指標2.0700.150 均陰性10100.004282.35 均陽性00.00917.65

A：IDH1 R132H在腦膠質瘤中的陽性表達(陽性對照)； B：HIF-1α在乳腺癌中的陽性表達(陽性對照)； C：VEGF在肝癌中的陽性表達(陽性對照)； D：IDH1R132H在正常腦組織中的陰性表達(陰性對照)； E： HIF-1α在正常腦組織中的陰性表達(陰性對照)； F： VEGF在正常腦組織中的陰性表達(陰性對照)。圖1 IDH1 R132H、HIF-1α及VEGF的陽性對照及正常腦組織陰性對照(×400)

A： IDH1 R132H 在膠質瘤細胞核上陽性表達； B： HIF -1α 在膠質瘤細胞核的陽性表達； C：HIF -1α在膠質瘤細胞核的陽性表達； D： VEGF 在膠質瘤細胞質中的陽性表達。圖2 IDH1 R132H、HIF-1α及VEGF在腦膠質瘤中的陽性表達(×400)

2.2 不同病理特征腦膠質瘤的IDH1 R132H、HIF-1α及VEGF的表達 IDH1R132H陽性表達21例，組織分級中：III級表達最高57.14%(8/14)，II級表達次之50.00%(10/20)，IV級表達最低0(0/6)；性別分組中：男性陽性表達較高50%(13/26)，女性陽性表達率為32%(8/25)；在年齡分組中：中年組(45～59歲)表達最高57.14%(8/14)，老年組表達最低33.33%(3/9)；在位置分組中：頂葉表達最高80%(4/5)，額葉表達最低(3/14)；經統計學分析，IDH1R132H蛋白的表達與性別、年齡、組織分級及位置無關(P>0.05)。HIF-1α陽性表達有24例，組織分級中：IV級表達最高83.33%(5/6)，II級表達最低35.00%(7/20)；性別分組中：男性陽性表達較高53.85%(14/26)，女性陽性表達率為40.00%(10/25)；年齡分組中：老年組表達最高77.8%(7/9)，青年組表達最低32.14%(9/28)；位置分組中：顳葉表達較高50.00%(3/6)，額葉表達最低21.42%(3/14)；經統計學分析，年齡分組中中年及老年差異有統計學意義(P<0.05)；HIF-1α的陽性表達與性別、組織分級及位置無關(P>0.05)。VEGF表達陽性有31例，在組織分級中：I級表達最高72.73%(8/11)，IV級表達最低50.00%(3/6)；性別分組中：女性陽性表達較高64.00%(16/25)，男性陽性表達率為57.69%(51/26)；年齡分組中：老年組表達最高66.67%(6/9)，中年組表達最低57.14%(8/14)；在位置分組中：顳葉表達較高76.92%(10/13)，枕葉表達最低16.67%(1/6)；經分析，VEGF在膠質瘤的位置分組中差異有統計學意義(P<0.05)；VEGF陽性表達與性別、年齡、組織分級無關(P<0.05，見表2)。

表2 IDH1R132H、HIF-1α及VEGF陽性表達與臨床病理特征的關系

指標例數IDH1R132H陽性(%)χ2PHIF-1α陽性(%)χ2PVEGF陽性(%)χ2P三陽性陽性(%)χ2P性別男2613(50.00)1.710.19214(53.85)0.980.32215(57.69)0.210.6457(26.9)3.140.076女258(32.00)10(40.00)16(64.00)2(8.00)年齡<45歲2810(35.71)2.0470.3599(32.14)6.4810.03917(60.71)0.2090.9013(10.71)2.1780.33745^59歲148(57.14)8(57.14)?8(57.14)4(28.57)≥60歲93(33.33)7(77.78)6(66.67)2(22.22)分級I級113(27.27)7.050.0695(45.45)0.8060.8488(72.73)1.280.7340(0)4.9370.154II級2010(50.00)7(35.00)11(55.00)5(25.00)III級148(57.14)7(50.00)9(64.29)4(28.57)IV級60(0.00)5(83.33)3(50.00)0(0)位置額葉143(21.42)5.7310.2213(21.42)6.6180.1587(50.00)11.0060.0261(7.14)4.1720.390顳葉136(46.15)7(53.85)10(76.92)3(23.08)枕葉63(50.00)3(50.00)1(16.67)##0(0)頂葉54(80.00)2(40.00)2(40.00)1(20.00)其他部位135(38.46)9(69.23)11(84.62)4(30.77)

*：45～59歲與≥60歲，P<0.05；##：枕葉與其它位置相比，P<0.01。

2.3 IDH1R132H、VEGF及HIF-1α 3個指標之間兩兩比較的相關性分析 51例腦膠質瘤中，VEGF蛋白陽性表達率為60.78%(31/51)，HIF-1α蛋白陽性表達率為47.06 %(24/51)；VEGF、HIF-1α蛋白均陽性者18例，均陰性者14例，VEGF蛋白陽性且HIF-1α蛋白陰性者13例，VEGF蛋白陰性且HIF-1α蛋白陽性者6例，VEGF與HIF-1α蛋白表達呈正關聯，關聯強度：1.67 (χ2=3.84，P=0.05)，95%CI：[1.00，2.76](見表3)。IDH1R132H蛋白陽性表達率為41.18%(21/51)，HIF-1α蛋白陽性表達率為47.06%(24/51)；IDH1R132H、HIF-1α蛋白均陽性者10例，均陰性者16例，IDH1R132H蛋白陽性且HIF-1α蛋白陰性者11例，IDH1 R132H蛋白陰性且HIF-1α蛋白陽性者14例，IDH1R132H與HIF-1α蛋白表達無明顯關系， (χ2=0.004，P=0.948，見表4)。VEGF蛋白陽性表達率為60.78%(31/51)，IDH蛋白陽性表達率為41.18%(21/51)；VEGF、IDH1R132H蛋白均陽性者15例，均陰性者14例，VEGF蛋白陽性且HIF蛋白陰性者16例，VEGF蛋白陰性且HIF-1α蛋白陽性者6例，IDH1R132H與HIF-1α蛋白表達無明顯關聯(χ2=1.697，P=0.183，見表5)。

表3 VEGF、HIF-1α蛋白在腦膠質瘤組織中表達的相關性分析(n=51)

VEGFHIF+-合計+181331-61420

表4 IDH1R132H、HIF-1α蛋白在腦膠質瘤組織中表達的相關性分析(n=51)

IDH1R132HHIF+-合計+101121-141630

表5 IDH1R132H、VEGF蛋白在腦膠質瘤組織中表達的相關性分析(n=51)

VEGFIDH1R132H+-合計+151631-61420

3 討論

腦膠質瘤是發生于神經外胚層的腫瘤，目前被認為是顱內原發腫瘤發病率最高的，根據美國腫瘤注冊中心(central brain tumor registry of the united states,CBTRUS)統計，膠質瘤占所有中樞神經系統腫瘤的27%，占惡性腫瘤的80%[3]，因其較高的致死率及致殘率，目前對其研究越來越多。

生物體內的IDH1(NADP-依賴型IDH)可催化異檸檬酸的氧化脫羧生成α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid,α-KG)，當該基因發生突變時，會產生大量的2-羥基戊二酸(2-hydroxyglutaric,2-HG)堆積， 2-HG的堆積大量消耗2-羥基戊二酸脫氫酶。2-HG大量堆積可以影響大腦內白質的結構及功能，導致腦內白質病變，同時2-HG抑制腦膠質瘤干細胞分化，上調血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)促進腫瘤微環境的形成，產生高水平的HIF-1α，促進膠質瘤侵襲，最終這些改變將導致腦膠質瘤的發生發展[13-14]。HIF-1α對維持腫瘤細胞的能量代謝、血管生成、促進腫瘤細胞增殖及轉移起重要作用[15]。膠質瘤的特征是快速失控的生長導致缺氧區域和壞死[16]。這也為HIF-1α穩定表達提供條件，進一步導致腫瘤細胞不斷增生。

李金磊等[17]通過實驗證實HIF-1α在高級別膠質瘤中表達高于低級別膠質瘤，即HIF-1α的表達與膠質瘤的惡性程度成正相關，可以作為判斷腦膠質瘤預后的指標。而謝燕等[18]對135例膠質瘤組織切片進行實驗并得出HIF-1α的表達與預后呈正相關，同時與性別、部位無相關性。而本實驗發現，HIF-1α的表達與年齡有關，老年人的表達明顯最高，青年表達最低(P<0.05)，且高級別膠質瘤的表達高于低級別膠質瘤，提示年紀越大，HIF-1α表達越高，惡性程度越高，預后越差。同時我們實驗發現HIF-1α與VEGF呈正關聯。可能的機制為HIF-1α表達增加，可促進VEGF mRNA的表達，增加VEGF的表達。

郭克勤等[19]通過實驗發現， VEGF與膠質瘤的新生血管生成密切相關，主要以旁分泌方式作用于細胞上的兩種受體誘導血管形成，同時發現VEGF在高級別膠質瘤中表達高于低級別膠質瘤。魏秀麗等[20]通過實驗證實VEGF在膠質瘤中的表達與分級有關，與性別、年齡及部位無關。而本實驗發現VEGF的表達與部位有關(P<0.05)，高級別膠質瘤表達高于低級別膠質瘤，但與分級無統計學差異(P>0.05)之所以如此，可能跟本實驗樣本量較少，結果為人工判讀存在一定誤差有關。

研究表明[10]：在膠質母細胞瘤中，IDH1突變的組織中，HIF-1α及血清中的VEGF的水平顯著增加。而本實驗發現IDH1R132H、HIF-1α及VEGF在正常對照組中不表達，膠質瘤中明顯高表達(P<0.05)，3個指標均陽性表達有9例，與膠質瘤患者的性別、年齡、分級及部位無關(P>0.05)，3個指標均陽性在II、III級中表達，但與膠質瘤的分級無統計學意義，考慮可能與實驗樣本量不足及結果判讀有關。

綜上所述， HIF-1α表達與年齡有關，VEGF的表達與膠質瘤部位有關，HIF-1α與VEGF在膠質瘤的發展中起協同作用。